粒细胞集落刺激因子通过促进肾脏分泌EPO刺激小鼠脾红细胞生成作用的研究

发布时间：2017-11-22 05:14

  本文关键词：粒细胞集落刺激因子通过促进肾脏分泌EPO刺激小鼠脾红细胞生成作用的研究

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【摘要】：[研究背景]粒细胞集落刺激因子(Granulocyte colony-stimulating factor, G-CSF)是体内重要的细胞因子,能促进粒细胞生成和增强粒细胞活性,临床上用于治疗各种原因引起的粒细胞减少症和动员造血干/祖细胞用于造血干/祖细胞移植。近期有文献研究提示G-CSF可促进肿瘤转移和加重肿瘤患者贫血症状；G-CSF动员造血干细胞之后,会造成健康捐献者造血干细胞长时间基因表达异常；长时间使用G-CSF治疗先天性粒细胞减少症可增加患白血病的概率；而我们在前期实验中发现,分泌G-CSF的乳腺癌细胞可造成小鼠红细胞生成系统紊乱,骨髓红细胞生成受到抑制,脾红细胞生成功能增强。促红细胞生成素(Erythropoietin,EPO)是红细胞生成的关键细胞因子,机体内的EPO主要是由肾小管间质细胞分泌。G-CSF是否可通过改变机体EPO水平影响造血系统,目前尚缺乏有效的文献支持。研究G-CSF诱导红细胞生成系统功能紊乱的机制,从不同角度评价G-CSF对机体的作用,可使我们更好的理解G-CS F的药理活性和不良反应,并有助于进一步阐明G-CSF与肿瘤的发生发展的关系,为G-CSF临床合理用药和肿瘤治疗提供重要参考；同时可拓展我们对脾脏功能的认识,有利于深入理解机体红细胞生成系统的调控机制。[研究目的]研究粒细胞集落刺激因子(G-CSF)诱导脾脏红细胞生成的作用机制,分析EPO在脾红细胞生成中的功能,评价肾脏功能对脾红细胞生成能力的影响。[研究方法]1.给予C57BL/6J小鼠皮下注射粒细胞集落刺激因子G-CSF,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119 (或APC Rat Anti-Mouse Ter119)和PE Rat Anti-MouseCD71双参数标记,流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞和脾细胞中Ter119和CD71双阳性(CD71+Ter119+)细胞群体所占比例。2.给予小鼠皮下注射G-CSF,采用APC Rat Anti-Mouse Ter119 和 Thiazole orange双参数标记,流式细胞仪检测小鼠骨髓细胞和脾脏细胞中网织红细胞(Ter119+Thiazole orange+)和有核红细胞(原红细胞和幼红细胞,Ter119+Thiazole orange++)占总细胞比例。3.给予小鼠皮下注射G-CSF,对小鼠骨髓与外周血进行细胞涂片,采用Wright-Giemsa染色,显微镜下观察。4.给予皮下注射G-CSF,取小鼠脾脏细胞原代培养CFU-E (Colony Forming Units-erythrocyte),显微镜下观察CFU-E集落形成情况。5.为探究G-CSF诱导的脾脏红细胞生成作用是否与EPO有关,给予小鼠皮下注射G-CSF,心脏取血,离心取血清,采用ELISA方法检测小鼠血清中EPO的浓度。6.给予小鼠皮下注射G-CSF,取小鼠肾脏,提取组织RNA,逆转录成DNA后通过RT-PCR检测小鼠体内肾脏组织中EPO的mRNA水平。7.给予小鼠皮下注射促红细胞生成素EPO,取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+各细胞群体所占比例。8.给予小鼠体内注射EPO,取小鼠脾脏,制成单细胞悬液,Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏中Ter119+ Thiazole orange+(网织红细胞),Ter119+ Thiazole orange++(原红细胞和幼红细胞)群体所占比例。9.给予小鼠体内注射G-CSF的同时,给予小鼠尾静脉输红细胞,采用FITC Rat Anti-Mouse Terl 19/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞所占比例。采用Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏细胞,观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。10.给予小鼠体内注射G-CSF的同时,给予小鼠注射EPO抗体,封闭小鼠体内EPO,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/ Thiazole orange双染流式检测小鼠脾脏细胞,观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。11.给予小鼠体内注射G-CSF的同时,给予小鼠喂服腺嘌呤,破坏小鼠双肾,阻断EPO分泌,后采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/Thiazole orange双染流式检测小鼠脾脏细胞,观察网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。12.给予小鼠体内注射G-CSF,后对实验组小鼠实施双侧肾脏切除手术,阻断EPO来源。2天后,处死小鼠,采用FITC Rat Anti-Mouse Ter119/PE Rat Anti-Mouse CD71双染法流式检测小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞群体所占比例。采用Ter119/噻唑橙双染流式检测小鼠脾脏细胞,观察成熟红细胞,网织红细胞与原红幼红细胞所占比例。13.给予小鼠体内注射G-CS F,分别给药1天、2天,取小鼠肾脏,提蛋白,采用免疫印迹法检测在受G-CSF刺激后小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α、HIF-2a的表达情况。[研究结果]1.在给予小鼠体内注射G-CSF后,小鼠股骨变白,骨髓细胞数减少,细胞中Ter119+CD71+细胞比例下降。相对应小鼠脾脏变大,颜色加深,细胞数增多,细胞中Ter119+CD71+细胞比例上升。2.在给予小鼠体内注射G-CSF后,噻唑橙染色结果得出小鼠脾脏细胞Ter119+Thiazole orange+,Ter119+Thiazole orange++群体均有显著上升,而小鼠骨髓细胞中Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++细胞均明显减少。3.细胞涂片结果显示：注射了G-CSF、鼠的骨髓细胞中红细胞数减少,粒细胞数增多。注射了G-CSF小鼠的外周血细胞涂片结果显示：外周血中粒细胞总数增多。4.原代培养CFU-E结果显示,皮下注射G-CSF后小鼠脾脏细胞中CFU-E明显增多。5. ELISA测定小鼠血清中EPO结果显示,给予小鼠G-CSF刺激以后,小鼠血清中EPO水平明显上升。6. RT-PCR结果显示,在给与小鼠G-CSF刺激后,小鼠肾脏中EPO的mRNA水平显著上升。7.检测受G-CSF刺激的小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α 与 HIF-2α表达水平。Western b lot结果显示,给与小鼠G-CSF刺激后,小鼠肾脏中缺氧诱导因子HIF-1α 与 HIF-2α表达水平上升。8.给予小鼠外源性EPO刺激后,小鼠脾脏细胞中Ter119+CD71+细胞比例上升。APC Rat Anti-Mouse Ter119和噻唑橙染色结果显示脾脏细胞中Ter119+ Thiazole orange+(网织红细胞),Ter119+ Thiazole orange++(原红细胞和幼红细胞)群体均有显著上升。9.在使用G-CSF刺激小鼠后,给小鼠尾静脉输入红细胞,流式检测脾脏细胞,发现相比G-CSF给药组,G-CSF给药同时输红细胞组Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+Thiazole orange+, Ter119+Thiazole orange++细胞比例降低至正常对照组小鼠水平。10.在小鼠受到G-CSF刺激的情况下,给小鼠注射一定量的EPO抗体封闭小鼠体内EPO的功能,流式检测脾脏细胞,发现Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,ter119+Thiazole orange++细胞比例恢复至正常对照组小鼠水平。11.在小鼠受到G-CSF刺激的情况下,同时给予小鼠喂服腺嘌呤,小鼠脾脏细胞数恢复正常,流式细胞仪检测其脾脏细胞,发现Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++细胞比例恢复至正常对照组水平。如果同时再给脾脏恢复正常的小鼠外源EPO刺激,脾脏再度增大,细胞数增多,Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+ Thiazole orange+, Ter119+ Thiazole orange++细胞比例再次上升。12.给小鼠G-CSF刺激一段时间后,切除小鼠双侧肾脏,两天后取脾脏,发现鼠脾脏明显缩小,流式检测其脾脏细胞,发现Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+Thiazole orange+,ter119+ Thiazole orange++细胞比例相比G-CSF给药组亦明显降低。而后再给脾脏恢复正常的小鼠外源EPO刺激,脾脏再度增大,Ter119+CD71+细胞比例,Ter119+ Thiazole orange+,Ter119+ Thiazole orange++细胞比例再次上升。[结论]粒细胞集落刺激因子(G-CSF)抑制小鼠骨髓红细胞生成,造成机体缺氧,促进肾脏缺氧诱导因子HIF-1α和HIF-2α表达,进而促进肾脏间质细胞分泌促红细胞生成素(EPO),然后刺激小鼠脾脏红细胞生成。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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