miRNA对Cripto-1高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭的调控作用及机制研究

发布时间：2017-11-22 15:28

  本文关键词：miRNA对Cripto-1高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭的调控作用及机制研究

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【摘要】：恶性肿瘤是一种发病率和致死率都非常高的疾病,其发生机制尚不十分清楚。Cripto-1蛋白又称为畸胎瘤衍生生长因子-1(Teratocarcinoma-derived growth factor 1,TDGF-1),是表皮生长因子(Epidermal growth factor,EGF)/Cripto-1-FRL-1-Cryptic(CFC)家族的一员。已有研究证明,Cripto-1主要在胚胎发育的早期阶段表达,在正常组织中不表达或者低表达,而在恶性肿瘤中又重新表达,并能促进细胞增殖、迁移、侵袭、上皮间质转化和肿瘤血管的发生。这表明Cripto-1是一个与肿瘤发生密切相关的癌基因,因此深入研究Cripto-1蛋白的表达调控及其机制具有重要意义。miRNA是一种非编码RNA,可以与靶基因mRNA 3'UTR特异性结合,通过抑制翻译或者使mRNA降解导致基因沉默,在癌基因表达调控和肿瘤发生中发挥着不容忽视的作用,但是miRNA是否也参与了Cripto-1蛋白的表达调控尚不清楚。在本研究中,我们利用TargetScan、PicTar、miRBase Targets生物信息学软件预测Cripto-1 mRNA 3'UTR上潜在的miRNA结合位点。通过荧光素酶报告基因法筛选出调控Cripto-1 mRNA 3'UTR活性的miRNA,并初步探讨了miRNA对Cripto-1促肿瘤作用的调控作用及机制,得到以下结果。1.靶向Cripto-1 mRNA 3'UTR的mi RNA的预测及鉴定。我们利用生物信息学软件和Cripto-1 mRNA 3'UTR驱动的荧光素酶报告基因法筛选出调控Cripto-1表达的三种miRNA,分别是miR-1285-5p、miR-4776-3p和mi R-3929。随后我们利用qRT-PCR、western blot法分别从mRNA水平和蛋白水平上证实了这三种mi RNA对Cripto-1表达的抑制作用。之后我们还进行了miRNA靶向Cripto-1的反向验证。将这三种miRNA及Cripto-1表达载体(不包含3'UTR区)同时转染HeLa细胞,western blot实验结果显示,过表达的Cripto-1蛋白并未受miRNA的影响。此结果进一步证明了这三种miRNA通过与Cripto-1 mRNA 3'UTR相互作用来调控其表达。2.miRNA对Cripto-1高表达的肿瘤细胞的影响。为了检测这三种miRNA的生物学活性,我们首先利用MTT法检测了它们对Cripto-1高表达的肿瘤细胞活力的影响。结果显示,miR-1285-5p、mi R-4776-3p、miR-3929对人宫颈癌细胞HeLa的活力具有抑制作用。BrdU掺入实验和Ki67免疫荧光染色实验显示,miR-1285-5p、miR-4776-3p、miR-3929能够抑制人宫颈癌细胞HeLa的增殖。Boyden小室实验以及划痕实验结果显示,miR-1285-5p、miR-4776-3p、mi R-3929对人宫颈癌细胞HeLa的侵袭、迁移能力具有抑制作用。3.miRNA调控Cripto-1高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭的作用机制研究。DAPI染色及Annexin V-FITC/PI双染法流式细胞术结果显示,这三种miRNA可诱导Cripto-1高表达的肿瘤细胞发生凋亡。进一步的免疫印迹分析结果显示,这三种miRNA可以增加cleaved caspase-9和cleaved caspase-3的水平,同时可下调Bcl-2/Bax的表达比率,提示这三种miRNA可通过线粒体途径促进HeLa细胞的凋亡。通过流式细胞术检测细胞周期发现,这三种miRNA可使细胞周期阻滞于G2/M期,进而抑制HeLa细胞增殖。细胞周期相关蛋白的免疫印迹分析结果表明,这三种miRNA可上调HeLa细胞中CDK2、p27蛋白的表达,同时下调cyclin E的表达。为了研究miRNA抑制细胞迁移及侵袭的机制,我们利用免疫印迹法检测了这三种miRNA对EMT相关蛋白表达的影响。结果显示,这三种miRNA均可以促进E-cadherin蛋白的表达,而抑制N-cadherin、Vimentin和MMP9的表达,提示这三种miRNA可以影响HeLa细胞EMT相关蛋白的表达。综上所述,本研究初步探讨了miRNA对Cripto-1高表达的肿瘤细胞增殖及侵袭的调控作用及机制,从而为以Cripto-1为靶点的肿瘤诊断和治疗奠定坚实的理论基础。
【学位授予单位】：东北师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.2

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本文编号：1215192