ShRNA沉默ARD1基因对大肠癌SW620细胞株奥沙利铂化疗敏感性的影响

发布时间：2017-11-25 10:09

  本文关键词：ShRNA沉默ARD1基因对大肠癌SW620细胞株奥沙利铂化疗敏感性的影响

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【摘要】：目的：本实验以人大肠癌细胞SW620细胞株为研究对象,采用RNA干扰技术、RT-PCR法、AnnexinV FITC/PI双染法、PI单染法等,在细胞水平上,探讨shRNA沉默ARD1基因对大肠癌细胞奥沙利铂化学治疗敏感性的影响,从而探讨ARD1基因在大肠癌细胞奥沙利铂化疗过程中作用及其机制。为大肠癌化学治疗及分子靶向治疗提供实验依据及理论基础。方法：1.人大肠癌SW620细胞株、人大肠癌shRNA-NC SW620细胞株、人大肠癌shRNA-ARD1 SW620细胞株的复苏、培养；2.用RT-PCR检测SW620细胞株、shRNA-NC SW620细胞株、shRNA-ARD1SW620细胞株ARD1 mRNA的表达水平,计算shRNA-ARD1 SW620稳定转染细胞株的沉默率；3.实验分组：大肠癌SW620细胞株(空白对照组)、大肠癌shRNA-NC SW620细胞株(阴性对照组)、大肠癌shRNA-ARD1 SW620细胞株(实验组)；4.噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度奥沙利铂作用不同时间后各组细胞的OD值,并计算各组细胞增殖抑制率及IC50值；5. RT-PCR技术检测不同浓度奥沙利铂处理后各组细胞ARD1 mRNA的表达水平；6.流式细胞术(PI单染法)检测不同浓度奥沙利铂处理后各组细胞的周期变化情况；7.流式细胞术(Annexin V FITC/PI染色法)检测不同浓度奥沙利铂处理各组细胞的总凋亡率及早期凋亡率；8.统计学处理：应用SPSS17.0统计软件进行统计学处理,两组均数的比较用t检验；多组均数的比较用方差分析；资料用均数±标准差(X±S)表示；显著性水准a=0.05。结果：1.人大肠癌SW620细胞、大肠癌shRNA-NC SW620细胞、大肠癌shRNA-ARD1 SW620细胞三株细胞成功培养且生长状况良好；2.RT-PCR检测各组细胞ARD1 mRNA的相对表达量：shRNA-ARD1 SW620细胞组的ARD1 mRNA相对表达量低于SW620细胞组、shRNA-NC SW620细胞组(P0.05),shRNA-ARD1 SW620培养48h后ARD1 mRNA相对表达抑制率达54.8%：3.MTT检测不同浓度(0.2.4、10、 16、32.64ug/ml) L-OHP处理48H后各组细胞的OD值,计算抑制率。各组细胞增殖抑制率随L-OHP浓度的增高而增高(P0.05),实验组组抑制率高于阴性对照组和空白对照组(P0.05),且实验组的IC50为(12±0.7) ug/ml低于阴性对照组的(15.5±0.68) ug/ml及空白对照组的(15±0.56)ug/ml降低(P0.05),用16ug/ml L-OHP作用于各组SW620细胞培养不同时间后MTT检测OD值,计算抑制率,各组SW620细胞抑制率随则L-OHP药物作用时间延长而增高,L-OHP处理的实验组抑制率高于阴性对照组和空白对照组(P0.05),阴性对照组与空白对照组统计学无意义(P0.05)。运用shRNA干扰技术沉默ARD1表达能提高人SW620细胞对L-OHP的敏感性,细胞增殖抑制作用明显加强并存在浓度、时间依赖性；4. RT-PCR检测经不同浓度(0、7.5、15.30ug/ml) L-OHP作用后各组细胞ARD1 mRNA相对表达量：随着L-OHP的浓度增高ARD1的mRNA相对表达水平降低(p0.05)。实验组ARD1的mRNA相对表达水平低于空白对照组及阴性对照组(P0.05),空白对照组与阴性对照组无明显差异(P0.05)。在细胞水平上奥沙利铂作用降低ARD1 mRNA的表达量,且随着L-OHP浓度增高各组细胞ARD1 mRNA的相对表达量越低；5.流式细胞术(PI单染法)检测在不同浓度L-OHP (0、5、15ug/ml)处理培养48h后各组细胞周期变化：在低浓度(5ug/ml)处理下各组细胞的G2/M期细胞比例高于无药物(Oug/ml)作用组(p0.05),实验组G2/M期细胞增高比例大于空白对照组及阴性对照组(P0.05),空白对照组与阴性对照组无明显差异(P0.05)。在高浓度(15ug/ml)的L-OHP作用下出现Sub-G1峰,其Sub-G1期细胞比例较低浓度奥沙利铂及无药物作用组明显增高(p0.01),其中实验组Sub-G1期细胞比例增高程度大于空白对照组及阴性对照组(P0.05)。shRNA沉默ARD1基因后在低浓度的L-OHP阻滞在G2/M期,在高浓度的L-OHP促进SW620细胞的凋亡；6.流式细胞术(AnexinV FITC/PI双染法)检测各组细胞株SW620细胞在不同浓度L-OHP (0、5、15ug/ml)处理培养48h后凋亡情况：低浓度L-OHP (5ug/ml)处理的各组细胞的总凋亡率较无L-OHP (0ug/ml)处理组增高(p0.05),早期凋亡率无明显差异(p0.05),实验组的细胞总凋亡增加较空白对照组及阴性对照组有差异(P0.05)。在高浓度L-OHP处理的各组细胞早期凋亡率及总凋亡率均有明显的增加(两者的p0.05),其中实验组总凋亡率较空白对照组及阴性对照组细胞组增加明显(P0.01)。shRNA沉默ARD1基因后L-OHP可以促进SW620细胞的凋亡,增加大肠癌SW620细胞对L-OHP的化疗敏感性；结论：1.shRNA沉默ARD1基因能提高大肠癌细胞奥沙利铂化疗的敏感性,抑制大肠癌细胞增殖；2.奥沙利铂在细胞水平上能降低大肠癌细胞ARD1 mRNA的表达量；3. shRNA沉默ARD1基因与低浓度奥沙利铂联合作用能促进大肠癌细胞细胞周期阻滞于G2/M期；与高浓度奥沙利铂联合作用促进大肠癌细胞的凋亡；4.shRNA沉默ARD1基因能促进奥沙利铂作用对大肠癌细胞的凋亡。
【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

【参考文献】

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本文编号：1225637