CDK抑制剂SNS-032对急性髓系白血病的杀伤作用及机制研究

发布时间：2017-11-30 08:30

  本文关键词：CDK抑制剂SNS-032对急性髓系白血病的杀伤作用及机制研究

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【摘要】：研究背景 急性髓细胞白血病(AML)是造血细胞恶性克隆性病变,其特点是白血病细胞在骨髓显著增生,抑制正常造血。成人AML的发生率明显高于急性淋巴细胞白血病,是最常见的急性白血病；并随年龄的增长而增加。目前采用联合化疗、造血干细胞移植等手段延长患者生存期,但仍有很大一部分患者无法耐受大剂量化疗副作用,或使用常规药物无效,最终复发。恶性肿瘤靶向药物研究是白血病治疗研究领域的热点,目前已有多种小分子抑制剂治疗AML进入临床研究。细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK)在调控细胞周期和基因转录中起重要作用,AML常有CDK活性异常增高,因此CDK抑制剂可能在治疗AML中发挥重要作用。 目的 1、研究CDK抑制剂SNS-032在体外对AML细胞株的生长抑制作用； 2、研究小分子抑制剂SNS-032对AML细胞的诱导凋亡作用； 3、研究白细胞介素6能否逆转SNS-032对AML的杀伤作用,从而克服耐药； 4、通过基因芯片和蛋白印迹实验研究SNS-032对白血病细胞杀伤的分子机制。 方法 1、台盼蓝染色法检测细胞活性。收集药物处理后的细胞,台盼蓝染色后,通过显微镜下直接计数,就可以对细胞存活率进行比较精确的定量。 2、应用MTT法,检测SNS-032对白血病细胞株生长抑制作用。 3、应用流式细胞仪,检测SNS-032作用后白血病细胞的凋亡情况。 4、基因芯片分析miRNA,检测SNS-032作用前后microRNA (miRNA)表达水平。 5、应用Western blot,检测SNS-032作用后JAK2/STAT3蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc表达情况以及IL-6对试验组JAK2/STST3蛋白表达的影响。 6、统计分析,应用Prime4软件统计,比较采用Dunnett-t法。 实验结果 1、 SNS-032对人AML不同细胞株的生长抑制作用：我们采用台盼蓝染色,通过人AML细胞株用药前及不同浓度下用药24h、48h后的拒染率分析,阐述不同人AML细胞株对SNS-032作用的反应。SNS-032浓度分别为25nmol/L、50nmol/L、100nmol/L,结果显示,SNS-032对各细胞株均有生长抑制作用,且呈浓度依赖性；其中MV4-11、U937细胞株生长抑制尤为明显,MV4-11细胞株24小时100nmol/L药物作用后平均拒染率为67.3%,48小时拒染率为53%,U937细胞株24小时100nmol/L药物作用后平均拒染率为71.7%,48小时拒染率为53.4%。 2、 SNS-032对人AML细胞株的诱导凋亡作用：采用流式细胞仪检测不同浓度SNS-032(100nmol/L、200nmol/L)作用于人AML细胞株24h,细胞的数量百分比变化,结果显示,SNS-032为100nmmol/L时,细胞凋亡率达12.1%,当SNS-032为200nmmol/L时凋亡率达59.4%,提示凋亡细胞呈浓度依赖性。 3、 SNS-032对人AML细胞株miRNA的影响：应用microRNA(miR)芯片分析SNS-032作用前后miR的差异表达,结果发现,SNS-032显著下调miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、 miR-106a、miR-17、miR-378c的表达水平,显著上调has-miR-320a。 4、 SNS-032对JAK/STST3途径相关蛋白的抑制作用：应用Western-blot技术检测SNS-032对JAK/STAT3蛋白表达的作用,结果显示SNS-032显著抑制JAK蛋白表达,抑制STAT3的磷酸化水平。此外,SNS-032对CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc也有显著的抑制作用。 5、(5)IL-6对SNS-032对白血病细胞作用的影响：应用Western-blot技术,对试验组联合IL-6进行分析,发现IL-6在HL-60细胞组可轻度上调JAK2和磷酸化STAT3,但不能逆转SNS-032对其的抑制作用,但在KG-1细胞株实验中IL-6轻度上调JAK2,明显激活STAT3,联合用药后能部分逆转对STAT3的激活作用。 结论 1、 SNS-032对多种人AML细胞株有生长抑制作用,呈时间-剂量依赖性。 2、 IL-6不能逆转SNS-032对AML细胞株HL-60的生长抑制作用,提示其可以克服耐药。 3、新型CDK抑制剂SNS-032能诱导AML细胞凋亡,浓度为200nM是能显著诱导HL-60细胞凋亡。 4、 SNS-032显著下调HL-60细胞miR-30a、miR-183、miR-20b、miR-26b、 miR-20a、miR-589、miR-107、miR-181a、miR-106a、miR-17和miR-378c的表达水平,显著上调hsa-miR-320a和miR-H7* 5、 SNS-032能显著抑制JAK/STAT3途径相关蛋白和CDK下游抗凋亡蛋白Mcl-1和c-myc的表达。 6、HL-60细胞株中SNS-032对JAK/STAT3的抑制作用不被IL-6逆转。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.71

【参考文献】

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1 ;Synthesis and antitumor activity of 7-azaindirubin[J];Chinese Chemical Letters;2009年05期

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本文编号：1238687