TLR4在肺癌相关巨噬细胞极性转化及其调控机制的研究

发布时间：2017-11-30 09:17

  本文关键词：TLR4在肺癌相关巨噬细胞极性转化及其调控机制的研究

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【摘要】：目的：研究TLR4是否参与肺癌相关巨噬细胞极性转化；阐明TLR4在肺癌相关巨噬细胞极性转化中的重要作用及其调控机制；探讨TLR4在肺癌相关巨噬细胞对肺癌进展的影响中所起的作用。方法：1. Kaplan-Meier Plotter软件分析临床肺癌病人生存率与TLR4和CD68的相关性；免疫荧光检测临床肺癌病人与对应病人正常组织样本中TLR4和CD68的表达。2.C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下接种LLC小鼠肺癌细胞株,比较TLR4敲除组与对照组细胞原发灶小鼠成瘤大小；免疫组化检测肿瘤组织中的巨噬细胞标记分子F4/80,M1型标记分子INOS, M2型标记分子Argl的表达变化。3. Real time PCR 及 Western Blot方法检测C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下肿瘤组织中M1型细胞标记分子如INOS、TNF-α、IL-1β、IL-6等和M2型细胞标记分子如Arg1、IL-10、MRC1等的表达变化,探讨TLR4对肺癌相关巨噬细胞极化的影响。4.转染RAW264.7小鼠肺巨噬细胞株使TLR4表达抑制,建立TLR4敲减的RAW264.7稳定转染细胞系,采用Real time PCR及Western Blot方法检测干扰效率；Real time PCR方法检测RAW264.7细胞敲减TLR4后,利用条件性培养基LCM刺激,糖酵解相关因子如SLC2A1、 HK1、 PFKP、PKM2、Aldolase、 LDH-5α等；ATP、乳酸测定法检测ATP及乳酸含量的变化。5.分离小鼠皮下肿瘤中的肿瘤相关巨噬细胞,进行Western-Blot、Real time PCR检测动物水平上糖酵解相关因子如SLC2A1、 HK1、PFKP、PKM2、Aldolase、 LDH-5α及相关蛋白P-AKT、P-mTOR、 HIF-1α、Bcl-6的表达变化。ATP、乳酸测定法检测ATP及乳酸含量的变化。6.流式细胞术检测RAW264.7细胞敲减TLR4后,利用条件性培养基LCM刺激,线粒体数量、功能以及线粒体ROS的表达变化。7. Western-Blot方法检测RAW264.7细胞敲减TLR4以及皮下肿瘤组织分离的TAM中影响糖酵解途径的相关蛋白p-AKT、p-mTOR、HIF-1α、Bcl-6的表达变化,探讨TLR4在肺癌相关巨噬细胞极性转化中的调控机制。8. 免疫组化方法检测C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠皮下肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、PCNA的表达变化。分离小鼠皮下肿瘤中的LLC细胞,进行MTS实验检测在C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中,对于Gefitinib诱导的细胞凋亡敏感性的变化；TUNEL实验检测C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC细胞的凋亡变化；体外迁移和侵袭实验检测C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC细胞的迁移和侵袭能力变化；肿瘤球实验和软琼脂实验检测C57BL/6小鼠和TLR4-/-小鼠中LLC细胞的肿瘤干性及克隆形成率,探讨TLR4在肺癌相关巨噬细胞对肺癌进展影响中所起的作用。9.构建pGL3-HIF-1α promoter报告基因质粒,将Bcl-6过表达质粒与重组报告基因质粒共转入RAW264.7细胞,检测双荧光素酶活性。研究HIF-1α与Bcl-6的相关性,探讨TLR4在肺癌相关巨噬细胞极性转化中的分子调控机制。结果：1. 临床肺癌病人生存率与TLR4及CD68的表达呈现负相关；临床肺癌病人标本中TLR4表达量异常高,尤其是在CD68标记的肺癌相关巨噬细胞。2.TLR4敲除组与对照组细胞相比原发灶小鼠成瘤显著减小。3.TLR4-/-小鼠肿瘤组织中M1型标记分子如INOS、 TNF-α、IL-41β、IL-6显著上调；C57BL/6小鼠肿瘤组织中M2型标记分子如Arg1、L-10、MRC1显著上调。4.TLR4表达量在RAW264.7敲减细胞中显著下调；稳定敲减TLR4的RAW264.7细胞中,与对照组相比,糖酵解相关因子如SLC2A1、HK1、PFKP、PKM2、 Aldolase、LDH-5α表达量显著上调；ATP含量显著下调,乳酸含量显著上调。5.RAW264.7细胞敲减TLR4后,与对照组相比,线粒体数量、功能及线粒体ROS的表达量显著下调。6.TLR4-/-小鼠和C57BL/6小鼠相比,皮下肿瘤组织中的肿瘤相关巨噬细胞,M1型标记分子如INOS、TNF-α、IL-1β、IL-6显著上调,M2型标记分子如Arg1、 IL-10、MRC1显著下调。糖酵解相关因子如SLC2A1、 HK1、PFKP、PKM2、 Aldolase、 LDH-5α表达量显著上调；ATP含量显著下调,乳酸含量显著上调。7.稳定敲减TLR4的RAW264.7细胞以及皮下肿瘤组织中的TAM,影响糖酵解途径的相关蛋白p-AKT、p-mTOR、Bcl-6的表达量显著上调,HIF-1α的表达量显著下调。8.与C57BL/6小鼠相比,TLR4-/-小鼠皮下肿瘤组织中增殖相关蛋白Ki67、PCNA显著下调；皮下肿瘤组织中的LLC细胞,对于Gefitinib诱导的细胞凋亡敏感性降低,细胞凋亡数量增加；LLC细胞的迁移和侵袭能力显著下降,同时抑制了LLC细胞的肿瘤干性以及生长速度。9.TLR4对Bcl-6具有靶向调控作用,能通过激活AKT-mTOR通路显著增强Bcl-6的表达,从而抑制HIF-1α的表达。结论：1.肺癌相关巨噬细胞中TLR4呈现显著高表达。2.TLR4参与了肺癌相关巨噬细胞极性转化的调控,能够通过促进线粒体代谢中的氧化磷酸化过程以及抑制糖酵解途径来促使肺癌相关巨噬细胞趋向于M2型极化；3.TLR4能够通过调控肺癌相关巨噬细胞促进肺癌细胞的侵袭、迁移、生长。4.TLR4通过激活AKT-mTOR通路特异性靶向Bcl-6分子,从而发挥对HIF-1α起抑制作用；
【学位授予单位】：杭州师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1238798