RNAi沉默RPL34基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和周期的影响

发布时间：2017-12-01 23:08

  本文关键词：RNAi沉默RPL34基因对人胃癌SGC-7901细胞增殖和周期的影响

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【摘要】：目的:胃癌是最常见的消化道肿瘤之一,胃癌的发生发展是一个多阶段、涉及多个基因参与的复杂过程。RPL34基因被认为在多种恶性肿瘤的发生、发展过程中发挥重要作用,参与调控肿瘤细胞的分化、增殖和凋亡等多个生物学途径。本研究通过构建RPL34特异性si RNA慢病毒载体,感染胃癌SGC-7901细胞,设置阴性对照组和干扰组,应用Real-time PCR方法检测两组细胞干扰的效果,MTT法检测RPL34在RNAi作用下的细胞增殖率,流式细胞术检测细胞周期变化。通过本实验为进一步研究RPL34基因应用于肿瘤基因治疗奠定基础,为胃癌的治疗提供新的策略。方法:1.重组慢病毒感染胃癌SGC-7901细胞将胃癌SGC-7901细胞分为两组,实验组和阴性对照组分别转染RPL34-si RNA慢病毒载体和si RNA阴性对照慢病毒载体。感染前将胃癌细胞接种于6孔板,培养24h后,加入慢病毒浓缩液20ul进行感染,72h后在荧光显微镜下观察GFP表达情况,计算感染效率。2.Real-time PCR检测RNAi对目的基因的干扰效果Trizol法抽提细胞RNA,采用Oligo(d T)引物和随机引物进行逆转录,以各组细胞c DNA作为模板,每组设立3个复孔进行Real-time定量PCR检测。3.MTT法检测RPL34基因在RNAi作用下的细胞增殖率取2组对数生长期细胞接种于96孔板,每组设立3个复孔,分别在接种后1、2、3、4和5d每孔加入浓度为5g/L MTT溶液10ul,培养4h后弃去上清,每孔加入DMSO100ul,震荡溶解后,使用酶标仪在490nm波长处测定吸光度(A)值,记录结果并绘制细胞生长曲线。4.利用流式细胞术检测细胞周期胰酶消化经慢病毒感染后处于对数生长期细胞,使细胞完全分散为单个细胞,然后用预冷的PBS液洗涤3次,15000rpm离心10min后收集细胞,弃去上清,加入1ml预冷PBS液重悬细胞,加入PI(1:100)及RNase(1:100)避光冰浴10min,流式细胞仪检测细胞周期。结果:浓缩后的重组慢病毒感染人胃癌SGC-7901细胞,48h后在荧光显微镜下观察到细胞绿色荧光表达强度高,细胞生长状态良好,表明慢病毒已稳定感染胃癌细胞。实时荧光定量PCR检测结果显示,与阴性对照组对比,实验组RPL34表达水平明显受到抑制(P0.05),提示RPL34-si RNA能有效沉默胃癌SGC-7901细胞的RPL34基因。MTT实验结果提示实验组细胞较阴性对照组总体生长速度降低(P0.05),提示靶向抑制RPL34基因表达后可显著降低胃癌细胞的增殖活力。流式细胞仪检测细胞周期实验提示实验组S期细胞明显减少(P0.05),而G2/M期细胞增加(P0.05),说明RPL34基因表达下调后,细胞有丝分裂明显减缓,细胞增殖受到明显抑制,促进细胞凋亡。结论:1.慢病毒介导的RNAi能稳定有效地下调RPL34基因的表达。2.抑制RPL34基因的表达后,胃癌SGC-7901细胞的生长速率和有丝分裂明显减缓。3.RPL34基因在维持胃癌细胞生物学方面发挥重要作用,可能为胃癌的基因靶向治疗提供新的思路。
【学位授予单位】：皖南医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.2

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3 石s，

本文编号：1242762