ApoG2抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

发布时间：2017-12-02 07:03

  本文关键词：ApoG2抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡的实验研究

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【摘要】：研究背景：乳腺癌是女性常见的恶性肿瘤之一,2014年美国女性恶性肿瘤发病率中29%为乳腺癌,高居榜首,而女性恶性肿瘤病死率中15%为乳腺癌,仅次于肺癌。中国抗癌协会公布的统计表明我国近年来乳腺癌的发病率亦呈逐年上升态势,占女性恶性肿瘤发病率中的第1位,死亡率的第4位。同时,患者发病年龄渐趋年轻化。针对乳腺癌的各种研究层出不穷,治疗方案也在不断推陈出新,但对于中晚期乳腺癌患者,规范治疗中以及治疗完成后出现的复发、转移是乳腺癌治疗过程中的难点和热点,因此进一步寻找控制乳腺癌复发、转移的方法迫在眉睫。近年来,针对乳腺癌的基础研究以及诊断、治疗方案都取得了很大的进展,乳腺癌应视为一全身性疾病并给予综合治疗的观点逐渐得到业内人士的广泛认同。当前乳腺癌治疗手段可分为手术治疗、化学药物治疗、放射治疗、内分泌治疗、分子靶向治疗。根据患者肿瘤的生物学行为,以及患者身体基础情况,综合运用以上诸种治疗方案,针对肿瘤局部及全身进行治疗,可显著提高患者质量,延长患者生存期。在中晚期乳腺癌综合治疗中,化疗是其中至关重要的一环。中晚期乳腺癌患者化疗目的主要为控制肿瘤复发与转移,提高患者生活质量,延长患者生存时间。然而在治疗患者的同时,化疗也存在不可忽视的副作用。乳腺癌化疗常用的CAF、TAC、CMF等方案可导致患者出现恶心呕吐、骨髓抑制、神经损害、免疫功能紊乱、皮肤黏膜损害等副作用,进而使患者无法耐受,影响化疗效果。如果可以找到适当的药物,可以在杀灭乳腺肿瘤细胞的同时,减轻对正常组织的副作用,是当前广大患者和医务工作者的迫切需求。棉酚(gossypol)是一种黄色多酚羟基双萘醛类化合物,主要存在于锦葵植物棉花的根、茎、叶和种子内,在棉籽仁中含量最高。具有抑制精子发生和精子活动的作用。我国曾将其作为一种有效的男用避孕药。自60年代初至今,已有多项体内外实验表明,棉酚可以抑制多种肿瘤的生长,具有一定的抗肿瘤作用。棉酚主要有两种异构体,右旋棉酚和左旋棉酚,其中主要有效成分为左旋棉酚,可阻断Bc-2家族中抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-xL等与促凋亡蛋白Bax、 Bad等结合形成二聚体,进而诱导细胞凋亡。但左旋棉酚仍有一定的副作用,其分子结构两端各存在一个醛基,存在一定的毒性,其潜在副作用限制了左旋棉酚在抗肿瘤作用中的最大剂量。在这样的背景下,针对左旋棉酚进一步研究,对其结构进行改造,合成了Apogossypolone,简称ApoG2,其在左旋棉酚基础上去掉了两端的醛基,同时保留了抗肿瘤主要结构。其较左旋棉酚毒性小,副作用明显小于前者,抗肿瘤效果好,在肿瘤治疗方面有着更好的前景。本研究以高表达Bcl-2基因的人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231细胞以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR细胞为研究对象,重点研究ApoG2对上述3种乳腺癌细胞系的增殖抑制及诱导其凋亡的作用,同时对其中的乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR的耐药逆转进行了初步的研究。研究目的：本实验选取高表达Bcl-2的人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR作为研究对象,研究ApoG2对上述三种细胞系的增殖抑制作用、诱导凋亡作并探讨可能的作用机制,同时进一步研究了ApoG2对乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR的耐药逆转作用。方法：1.采用CCK8体外增殖法研究ApoG2在0μmol/L、10 μmol/L、20 40 μmol/L和80 μmol/L的浓度下作用24h、48h、72h后,对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR的体外增殖抑制作用；2. Hoechst 33342及PI双重荧光染色法观察20μ mol/L和40μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后引起的凋亡形态学变化；3.使用平板克隆实验检测5μmol/L、10μmol/L以及20μmol/L浓度的ApoG2持续作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 14d后细胞增殖能力的变化；4.使用Annexin V/FITC双染试剂盒,通过流式细胞仪检测20 μmol/L和40 μmol/L ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后引起的细胞凋亡率变化情况；5.使用JC-1线粒体膜电位检测试剂盒,通过流式细胞仪检测20 μmol/L和40 μ mol/L ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后引起的细胞线粒体活性变化情况；6.使用PI染色法,通过流式细胞仪检测20 μ mol/L和40 μ mol/L ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR后引起的细胞周期变化情况；7.使用划痕实验检测经5 μ mol/L以及10 μmol/L浓度的ApoG2作用于人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR后12h、24h细胞迁移能力的变化使用Western Blotting法检测经20 μ mol/L以及40 μ mol/L ApoG2分别处理24h及48h后的人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR Bcl-2蛋白、Bax蛋白、Caspase-3蛋白表达变化以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR中MDR1蛋白表达变化。结果：1.通过CCK8体外增殖实验检测提示,所选取的不同浓度的ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR,组间结果差异具有统计学意义(P0.05),相同药物浓度分别作用24h、48h、72h后,对人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR亦具有不同程度的增殖抑制作用(P0.05),作用效果随药物浓度或时间延长,增殖抑制作用逐渐加强,呈剂量-时间依赖性。同时可以发现药物浓度以及作用时间二者存在交互效应,药物浓度越高、作用时间越长,对肿瘤细胞的增殖抑制作用越强(P0.05)。2.使用Hoechst 33342及PI双重染色法观察20μmol/L和40μmol/L的ApoG2作用48h后的人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR后,于荧光显微镜下观察,可见阴性对照组细胞呈均匀淡蓝色；凋亡细胞细胞呈明亮蓝色及偏暗红色重叠后的淡紫色,并出现凋亡经典的核固缩、核碎裂、染色质凝集、凋亡小体形成等凋亡现象；坏死细胞呈明亮蓝色及明亮红色重叠后的亮紫色。随剂量增高,凋亡细胞及坏死细胞逐渐增多。3.使用平板克隆实验检测5μmol/L、10 μmol/L以及20 μmol/L浓度的ApoG2持续作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR后14d,细胞克隆形成能力较阴性对照组明显降低,差异有统计学意义(P0.05),提示低浓度ApoG2即可降低上述细胞系克隆形成能力。4.使用Annexin V/FITC双染试剂盒,通过流式细胞仪检测20 μmol/L和40 μmol/L ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后,各处理组之间细胞凋亡率差异具有统计学意义(P0.05),随药物浓度增加,凋亡率明显提高,提示ApoG2作用后可使上述细胞系系发生凋亡。5.使用JC-1染色线粒体膜电位检测试剂盒,通过流式细胞仪检测20 umol/L和40 μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后,各处理组之间细胞线粒体膜电位(MMP)的下降,且线粒体膜电位下降情况呈浓度相关性,提示ApoG2可使上述细胞系系细胞线粒体膜活性下降,线粒体损伤。6.使用PI染色法,通过流式细胞仪检测20 μ mol/L和40 μmol/L的ApoG2作用于人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 48h后,相较于阴性对照组,不同ApoG2药物处理组细胞被阻滞后G2期的比例明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),同时伴有不同程度G1/S期细胞比例增加,提示我们ApoG2可以引起上述肿瘤细胞系发生细胞周期阻滞。7.使用划痕实验检测5μ mol/L以及10μmol/L浓度的ApoG2作用于人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR 12h以及24h后,细胞迁移能力使得划痕变窄,结果显示上述ApoG2处理组较阴性对照组,划痕恢复速度明显弱于对照组,提示低浓度ApoG2可以抑制MCF-7/ADR的细胞细胞迁移能力。8.使用Western Blotting法检测经20 μ mol/L以及40 μ mol/L ApoG2分别处理24h及48h人乳腺癌细胞系MCF-7. MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR后,上述分组中Bcl-2蛋白表达较对照组降低(P0.05), Bax蛋白表达较对照组升高(P0.05)。3种细胞中Caspase-3蛋白表达表达较对照组升高(P0.05)。提示ApoG2处理48h后,上述3种细胞株出现凋亡。经20μmol/L以及40μ mol/L ApoG2分别处理24h及48h处理后的人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR,其MDR1蛋白表达较对照组降低(P0.05),提示ApoG2可使得MCF-7/ADR的耐药情况发生变化。9.结论：ApoG2可以明显抑制人乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231以及人乳腺癌耐药细胞系MCF-7/ADR的增殖能力,降低MCF-7/ADR细胞的迁移能力,诱导上述细胞系发生凋亡。其机制与Bcl-2家族蛋白表达改变及线粒体膜电位发生改变相关。
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R737.9

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前6条

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中国硕士学位论文全文数据库 前8条

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本文编号：1244022