Cu-PMPP-SAL诱导肿瘤细胞凋亡及其对TNFα激活的NF-κB通路的影响

发布时间：2017-12-12 09:05

  本文关键词：Cu-PMPP-SAL诱导肿瘤细胞凋亡及其对TNFα激活的NF-κB通路的影响

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【摘要】：金属配合物已经被认为是抗癌药物的潜在重要来源。一些基于铂的抗肿瘤药物,如顺铂,卡铂和奥沙利铂已被广泛使用于临床治疗。然而,由于这些药物有着严重的副作用和耐药性。因此,迫切需要开发高效性且低毒的抗癌药物。4-酰基吡唑啉酮类配合物,尤其是席夫基的衍生物,由于其具有多个活性配位点以及烯醇和酮结构的互变异构效应,而使得配位形成的新型络合物具有不同的结构。吡唑啉酮类金属络合物具有稳定性高,易于合成,易于修饰,有非常丰富的抗菌,抗病毒和抗癌等生物活性优势。核转录因子κB(Nuclear factorκB,NF-κB)是一种转录调控因子,其信号通路的失调与炎症性疾病和一些癌症相关。在乳腺癌、结肠癌、黑色素癌等癌症中已经发现了NF-κB信号通路的激活,因此可通过药物阻断NF-κB信号通路来治疗肿瘤。肿瘤坏死因子α(TNFα)是肿瘤细胞凋亡的诱导因子,但有研究发现,TNFα也能激活NF-κB的转录活性,进而使得癌细胞对化疗药物引起的细胞毒作用耐受。而吡唑啉酮类化合物是否对HeLa细胞内NF-κB信号通路产生影响尚未见报道。本研究在对25种吡唑啉酮衍生物进行抗肿瘤活性筛选的基础上,研究较高抗肿瘤活性的化合物Cu-PMPP-SAL体内外抑制癌细胞增殖,诱导癌细胞凋亡以及对肿瘤坏死因子α(TNFα)激活的NF-κB信号通路的影响,初步探讨Cu-PMPP-SAL抗肿瘤作用机制及药物毒性,可为新型吡唑啉酮金属配合物结构优化及抗肿瘤药物研制与开发应用提供基础资料。本文的研究结果主要包括以下内容:(1)通过MTT法检测发现吡唑啉酮衍生物作用HeLa细胞72 h后,化合物Cu-PMPP-SAL、Cu-PMPP-TAH、Cu-PMBP-TAH、Cu-PMPP-nSAL都具有很好的抗肿瘤活性,IC50值分别为:2.082μg/mL、1.287μg/mL、1.186μg/mL、2.559μg/mL,并发现Cu-PMPP-SAL对HeLa和Eca-109细胞生长抑制作用良好,值得进一步研究其作用机制。(2)cu-pmpp-sal对hela细胞具有生长抑制作用并通过caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导细胞凋亡。cu-pmpp-sal处理hela细胞后,通过hoechst33258染色法及透射电子显微镜观察发现细胞内产生了凋亡小体,核物质致密呈斑块状,边集于核膜;ldh活性检测显示细胞的ldh释放率上升,推测细胞膜可能出现了损伤;碘化丙锭(propidiumiodide,pi)单染色检测结果表明hela细胞周期停滞在在s期;annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测发现hela细胞产生了显著的凋亡变化(p0.05);cu-pmpp-sal显著降低细胞内线粒体膜电位水平(p0.05),并且能够激活caspase-3和-9的活性。此外,westernblot法研究发现化合物能够诱导hela细胞质内细胞色素c(cyto-c)含量上升,parp蛋白裂解,上调bax蛋白水平,下调bcl-2蛋白水平。提示cu-pmpp-sal可能通过caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导细胞发生凋亡。(3)cu-pmpp-sal可能通过抑制iκ-bα的磷酸化进而抑制nf-κb信号通路的激活。通过mtt法检测发现cu-pmpp-sal对tnf-α刺激后的hela细胞的生长具有抑制作用;nf-κb双荧光素酶报告基因检测结果表明,cu-pmpp-sal抑制了nf-κb的表达;westernblot检测结果证实了cu-pmpp-sal能够抑制hela细胞nf-κb信号通路上游的iκbα的磷酸化。由此说明cu-pmpp-sal可能通过抑制iκ-bα的磷酸化进而抑制nf-κb信号通路的激活,从而导致细胞死亡。(4)cu-pmpp-sal体内外抑制b16细胞的生长,并能通过抑制血管生成的方式抑制体内肿瘤组织的生长。通过mtt法检测发现cu-pmpp-sal能够抑制b16细胞增殖,其ic50值为4.021μg/ml,hoechst33258染色法显示细胞内有凋亡小体,pi单染和annexinv-fitc/pi双染流式细胞术检测结果表明细胞周期阻滞在g0/g1期,细胞凋亡率与对照组相比显著增加(p0.05)。检测化合物对b16荷瘤c57小鼠的作用结果显示,cu-pmpp-sal治疗组小鼠b16实体瘤生长速度较慢,肿瘤体积小于对照组(p0.05)。高、中、低浓度(30mg/kg、20mg/kg、10mg/kg)剂量治疗组的抑瘤率分别为54.8%、44.44%和35.58%。显微镜下可见中浓度、高浓度剂量组的肿瘤细胞有不同程度的点、片状的坏死,而肝、肺等组织并无明显的病理损伤。免疫组织化学法检测发现中浓度、高浓度剂量组中瘤体细胞中高度糖基化的I型跨膜糖蛋白(CD34)、血管内皮生长因子(VEGF)及碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的阳性表达指数都低于对照组(P0.01)。说明Cu-PMPP-SAL能在体内外以时间及剂量依赖性的方式抑制B16细胞的生长,并能通过抑制血管生成的方式抑制体内肿瘤组织的生长。(5)Cu-PMPP-SAL对小鼠毒性较小,具有较好的安全性。小鼠急性毒性试验显示,Cu-PMPP-SAL经腹腔注射LD50为:33 mg/kg,95%的可信限为:25.5-43mg/kg;高剂量组(200 mg/kg、400 mg/kg、800 mg/kg)使中毒小鼠均出现不同程度的呼吸心跳加快、抽搐等症状。小鼠死亡率随Cu-PMPP-SAL剂量的增加而增加,较阳性药物顺铂DDP剂量组(12.5 mg/kg)具有较好的安全性。综上所述,Cu-PMPP-SAL能通过caspase依赖的线粒体凋亡途径诱导HeLa细胞凋亡,并且还能通过抑制HeLa细胞内Iκ-Bα的磷酸化进而抑制NF-κB的活性。Cu-PMPP-SAL在体内外还能抑制B16细胞生长,可能通过抑制血管生成而有效地抑制B16实体瘤的生长。该化合物对小鼠急性毒性较小,具有较好的安全性。
【学位授予单位】：新疆大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R73-36

【参考文献】

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1 李志伟 ,鲁广恩 ,胡安国 ,杨五计 ,戴勇;VEGF表达及MVD与肝细胞癌侵袭、转移和预后的关系[J];中国现代医学杂志;2003年16期

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本文编号：1281911