HNF1α，HNF4α，FOXA3联合应用诱导肝癌细胞重编程

发布时间：2017-12-14 12:09

  本文关键词：HNF1α，HNF4α，，FOXA3联合应用诱导肝癌细胞重编程

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【摘要】：研究背景和目的肝癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率在恶性肿瘤中居第六位,病死率居第二位。尽管近年来肝癌的诊疗技术不断发展,其早期诊断困难、放化疗不敏感和复发转移率高的现状没有根本改观。唯一被FDA批准用于肝癌的靶向治疗的药物索拉非尼,治疗效果非常不理想。因此,肝癌的治疗研究亟需调整思路,寻找更加有效的治疗手段。肿瘤的诱导分化是近些年兴起的一种治疗方法,分化治疗可诱导低分化的肿瘤细胞向成熟表型分化,抑制其增殖和转移并促进其凋亡,从而达到治疗肿瘤的目的。迄今分化治疗应用最好的是利用全反式维甲酸治疗急性早幼粒白血病,已有大量的病人获得了很好的治疗效果。血液肿瘤分化治疗的成功也带动了实体肿瘤的分化治疗研究,相继出现了应用全反式维甲酸、二甲基亚砜和砷剂治疗乳腺癌、肺癌、结肠癌的研究,但肝癌的分化治疗研究目前还很少。肝细胞核因子(Hepatocyte nuclear factor,HNF)是一类在肝细胞中相对特异性高表达的转录因子,在肝细胞的分化和功能维持方面发挥重要作用。HNF家族包括HNF1、HNF3、HNF4、HNF6、CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)以及D-结合蛋白(DBP)6大类因子。已有研究显示单独应用HNF1α或HNF4α导入HNF1α或HNF4α低表达的肝癌细胞后,可以诱导肝癌细胞分化。但在相当一部分肝癌中HNF1α或HNF4α的表达并不降低,对这部分肝癌而言,单独应用HNF1α或HNF4α疗效有限。此外,将多种肝细胞核因子联合导入肝癌细胞协同发挥作用,理论上诱导肝癌细胞分化的效果可能更好。前期有学者从肝细胞特异性转录因子中筛选能诱导人成纤维细胞向肝细胞转分化的转录因子,最终筛选到了HNF1α、HNF4α和FOXA3(HNF3γ)。将这三种因子联合转入人成纤维细胞后,可将人成纤维细胞诱导成肝细胞(hi Heps,human induced hepatocytes)。hi Heps形态类似正常肝细胞,且具有肝细胞的标志物和生物学功能。在前期研究的基础上,本课题旨在联合应用HNF1α、HNF4α和FOXA3抑制肝癌恶性表型并诱导肝癌细胞向肝细胞重编程;希望藉此探索肿瘤细胞重编程的可能性及其可能机理,为癌症的治疗提供新的思路与方向。研究方法:1.通过realtime-RCR检测不同肝癌细胞系及正常肝细胞中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表达情况。2.通过免疫组织化学法检测肝癌组织芯片中HNF1α、HNF4α和FOXA3的表达情况。3.分别构建表达HNF1α、HNF4α和FOXA3的三种腺病毒,并用realtime-PCR和蛋白印迹法(Western blot)验证表达三种因子的腺病毒感染肝癌细胞后的表达情况。4.将HNF1α、HNF4α和FOXA3腺病毒感染肝癌细胞后,通过realtime-PCR检测肝细胞相关功能基因的表达水平。5.通过相差显微镜观察三因子诱导后肝癌细胞的形态改变。6.利用基因芯片检测并比较三因子诱导的肝癌细胞与对照细胞以及人原代肝细胞的基因表达差异。7.采用PAS、油红染色、LDL摄取、尿素及白蛋白分泌等肝功能相关实验,检测三因子诱导后的肝癌细胞肝功能的改善情况。8.通过流式细胞术及细胞成球实验检测三因子对肝癌干细胞的诱导分化。9.通过CCK8、克隆形成、transwell实验检测三因子诱导后肝癌细胞的恶性生物学特性改善情况。10.建立PDX(patient-derived xenograft)模型并通过瘤内注射三因子腺病毒,研究其体内治疗肝癌的效果。研究结果:1.不同肝癌细胞系中HNF1α、HNF4α和FOXA3三种肝细胞核因子的表达水平有较大差异。2.肝癌样本中的三因子表达存在异质性,且大多数癌中三因子表达均低于癌旁。3.联合应用HNF1α、HNF4α和FOXA3三种肝细胞核因子能上调肝癌细胞中大量肝功能相关基因表达,且三因子联合应用的效果显著优于HNF1α、HNF4α、FOXA3单因子及两两组合(1+4、1+F、4+F)的效果。4.经三因子诱导后肝癌细胞的形态较对照细胞更加扁平宽大,接近肝细胞的形态。5.基因芯片分析显示三因子诱导后肝癌细胞与对照细胞差异很大,其可以和人原代肝细胞聚类。6.三因子诱导后肝癌细胞的肝细胞相关功能,如糖原合成、脂质堆积、白蛋白摄入等较对照细胞得到很大改善。7.三因子联合应用能显著下调肝癌细胞中肝癌干细胞的比例并抑制其自我更新能力。8.经三因子诱导后肝癌细胞的恶性表型几近消失。9.PDX中注射三因子腺病毒可有效抑制肝癌生长并能增强其ALB表达并降低AFP表达。结论:HNF1α、HNF4α和FOXA3三种肝细胞核因子的在不同肝癌细胞中表达量差异较大,且大多数肝癌中三种因子表达均低;单一及两两组合的诱导效果远不及三种因子联合应用;经过三因子诱导的肝癌细胞不仅其恶性生物学特性得到抑制,还表现出较好的肝细胞形态和功能,提示三因子联合应用可能诱导肝癌细胞向肝细胞重编程。本研究拓展了肿瘤细胞重编程的认识,也为肝癌的治疗提供了新的思路。
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1287830