BENC-511对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的作用研究

发布时间：2017-12-19 01:01

  本文关键词：BENC-511对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的作用研究

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【摘要】：肺癌是严重威胁人类健康和生命的恶性肿瘤之一。近50年来肺癌的发病率和死亡率均明显增高,其发病率和死亡率均居所有恶性肿瘤的第一位。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)更是具有死亡率高、发病率高、易转移和耐药的特点。非小细胞肺癌包括鳞癌(鳞状细胞癌)、腺癌和大细胞癌,其癌细胞比小细胞癌生长分裂慢、扩散转移晚。在所有肺癌中NSCLC约占80%,大约75%的患者到了中晚期才发现病情,并且NSCLC的5年生存率非常低。对于肺癌的治疗,目前临床上常用的化疗药物主要是直接作用于细胞有丝分裂、DNA合成和修复等过程的传统细胞毒类药物,这些药物选择性低、毒性大。因此,以与肿瘤细胞分化增殖相关的信号通路的关键酶作为筛选靶点,寻找选择性作用于特定靶点的新型药物已成为当今抗肿瘤药物研发的重要方向。小分子抑制剂与传统的肿瘤化疗药物相比,具有更好的疗效和较小的毒副作用。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphoinositide 3-kinase, PI3K)是细胞生命活动中的关键信号分子,是脂激酶的一种,存在于体内各种细胞中。PI3K通过募集并激活下游靶物质,以启动一系列信号级联反应,在细胞生长、增殖、存活、分化、调亡、转移、代谢、转录和翻译等多种细胞生物学过程中发挥重要作用。研究表明PI3K/Akt信号通路与肿瘤的发生发展密切相关,以该通路中关键酶为靶点的抗肿瘤药物研究,目前已经成为肿瘤预防和靶向治疗的热点。化合物S14161结构为8-乙氧基-2-(4-氟苯基)-3-硝基-2氢-苯并吡喃,是一种作用确切的PI3K抑制剂,然而由于S14161的手性结构和较差的溶解性能抑制了其更进一步的应用。我院药物化学研究所刘兆鹏教授为获得活性更优的化合物,通过结构优化得到了S14161的类似物BENC-511,其结构为6-溴-8-乙氧基-3-硝基-2氢-苯并吡喃。前期实验显不BENC-511主要作用于PI3K/Akt通路,能显著抑制肿瘤细胞中Akt的磷酸化水平及下游信号蛋白的表达,具有良好的抗多发性骨髓瘤活性和较低毒性,但对人肺腺癌A549细胞的作用未见报道。本课题主要通过体外实验,以S14161为阳性对照药,研究化合物BENC-511对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的作用,并在进一步确证化合物抑制A549肿瘤细胞增殖和诱导凋亡的基础上,探讨其作用机制。采用MTT法及克隆形成试验观察BENC-511对人肺腺癌A549细胞增殖的影响；用倒置显微镜观察BENC-511处理后A549细胞形态的变化；流式细胞仪检测BENC-511对A549细胞周期DNA含量的影响,Western blot检测BENC-511对Cyclin A1、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)、p21、Caspase-3、Caspase-9和P-Akt等蛋白表达水平；Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术检测BENC-511对A549细胞凋亡的影响；JC-1检测BENC-511处理后A549细胞线粒体膜电位的变化。结果发现用不同浓度的BENC-511处理A549细胞24 h、48 h、72 h后,细胞活力的下降呈现浓度和时间依赖性,克隆形成实验结果与MTT结果一致,处理48 h后对A549细胞的抑制率呈现浓度依赖性；倒置显微镜观察细胞形态,结果显示经1.25、2.5、5μmol/L BENC-511作用的A549细胞形态变化显著,细胞密度明显减少,细胞逐渐皱缩、变圆,出现凋亡小体,呈浓度依赖性,10μmol/L BENC-511处理的A549细胞出现凋亡晚期现象：流式细胞仪结果显示,经BENC-511作用后,A549细胞S期细胞所占比例明显增多,BENC-511将细胞周期阻滞于S期；Annexin V阳性细胞随剂量的增加而增加,与S14161相比,10 μmol/L BENC-511诱导A549细胞凋亡作用更明显。Western blot结果显示,BENC-511可下调A549细胞Cyclin Al和PCNA的表达,上调p21蛋白表达,上调Caspase-3和Caspase-9蛋白表达,下调P-Akt表达,JC-1检测细胞线粒体膜电位的变化,发现BENC-511可使A549细胞线粒体膜电位下降,JC-1逐渐从红色荧光向绿色荧光转变。由上可知,BENC-511可以明显抑制人肺腺癌A549细胞增殖及诱导凋亡,可能是与影响周期蛋白表达和降低细胞线粒体膜电位有关,详细机制还需要进一步研究。
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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