复制选择性腺病毒在肺癌CTCs检测中的应用

发布时间：2017-12-20 19:05

  本文关键词：复制选择性腺病毒在肺癌CTCs检测中的应用　出处：《郑州大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：背景和目的中国肿瘤登记中心2015年报数据显示,肺癌在我国男性癌症患者中发病率占据第一位,女性患者中位居乳腺癌之后占据第二位,死亡率均占据第一位,其五年生存率为16.1%。2016年国家癌症中心在《CA Cancer J Clin》发布的2015年癌症统计数据显示,整体上肺癌是发病率及死亡率最高的肿瘤。循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)目前定义为自发或因诊疗操作过程中由实体瘤或转移灶释放进入外周血循环的肿瘤细胞。越来越多的证据显示,CTCs作为一种“液体活检”在肺癌复发的早期监测、疗效及预后的评估、个体化治疗等方面具有重大作用[1]。检测方法的发展使得CTCs的检出越来越可行,不断涌现的不同的富集及检测技术多依赖于肿瘤细胞的物理学(大小、密度、变形性等)及生物学(膜蛋白等)特性。如目前唯一被美国FDA通过的Cell Search系统通过包被抗上皮细胞粘附因子(epithelial cell adhesion molecule,EpCAM)抗体的免疫磁珠与血样中的癌细胞免疫结合而达到分离的目的,但在一些良性及炎性病变中同样发现了假阳性结果的存在[2],此外肺癌细胞由原发灶释放进入循环时发生的上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)会造成EpCAM的下调甚至不表达,该系统检测效率欠佳。实验通过构建的新型的端粒酶特异的复制选择性腺病毒Adll-Tel-GFP,在肺癌细胞中相对特异的选择性复制并表达绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP),在荧光显微镜下能够直接进行形态学观察及计数,通过对细胞系及临床样本进行检测,探究其灵敏性与特异性,探讨其临床应用价值。方法健康人全血经过裂解红细胞,于培养基中加入病毒后杂交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,荧光显微镜下观察gfp表达情况;选取肺癌细胞系a549,细胞消化计数1000个后加入10%dmem中,加入病毒后杂交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,荧光显微镜下观察gfp表达情况;肺癌细胞系a549消化计数100个细胞加入1ml健康人全血中,经过红细胞裂解,于培养基中加入病毒后杂交箱中37℃孵育24h,固定及dapi染色,荧光显微镜下观察计数表达gfp的细胞;临床肺癌患者外周血6ml经过红细胞裂解、加入病毒后杂交箱中37℃孵育24h、固定及dapi染色,荧光显微镜下观察并计数表达gfp的细胞;外周血经过红细胞裂解、病毒孵育、固定、抗cd45抗体标记白细胞及dapi染色,荧光显微镜下观察计数表达gfp同时抗cd45(-)的细胞;肺癌患者、健康志愿者及非恶性肿瘤疾病患者外周血6ml经过红细胞裂解、加入病毒后37℃杂交箱中孵育24h、固定及dapi染色,荧光显微镜下观察计数表达gfp的细胞,计算阳性率。结果1.在极少数健康人全血中可发现1~2个细胞表达gfp,但根据细胞形态及大小考虑为白细胞。2.ad11-tel-gfp能够感染人肺癌a549细胞,在细胞中大量复制并表达gfp。3.adll-tel-gfp能够感染健康人全血中的人肺癌a549细胞,在细胞中大量复制并表达gfp,灵敏度达96%。4.ad11-tel-gfp能够感染肺癌患者癌细胞,在癌细胞中复制并表达gfp,细胞大小测量均在10μm以上。同样可发现少量假阳性细胞,通过细胞形态及细胞大小同样考虑为白细胞。肺癌患者ctcs检测荧光显微镜下可见癌细胞团的存在。5.免疫细胞化学染色标记白细胞可帮助鉴定假阳性细胞,抗cd45抗体标记示假阳性细胞为白细胞,但增加免疫细胞化学染色步骤后阳性细胞数减少。6.根据相关结果,结合膜过滤法等原理,CTCs阳性结果标准:既发出绿色荧光,又具有蓝色细胞核结构的细胞,细胞核形状不规则,细胞最大径大于10μm判定为阳性细胞。依据上述标准,健康人及非肿瘤肺部疾病患者血样本可发现假阳性细胞,均未发现阳性细胞,与临床相符。7.根据肺癌TNM分期,非小细胞肺癌患者I期阳性率为40.0%,Ⅱ期为50.0%,Ⅲ期为46.6%,Ⅳ期为77.8%,差异无统计学意义(χ2=5.541,P=0.136)。早期(Ⅰ~ⅢA)阳性率为43.75%,晚期(ⅢB~Ⅳ)阳性率为72.73%,差异具有统计学意义(χ2=3.893,P=0.048)。小细胞肺癌患者局限期阳性率为20.0%,广泛期为76.9%,差异具有统计学意义(P=0.047)。结论实验构建的端粒酶特异的复制选择性腺病毒Ad11-Tel-GFP能够相对特异性的识别肺癌细胞,在临床前试验及临床试验中均具有良好的效果。该方法具有灵敏度高、特异性强等优点,是一种非常有效的检测CTCs的方法,与临床分期具有一定的相关性,在评估疗效、预后及个体化治疗等方面具有巨大的潜力。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R734.2

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本文编号：1313063