β-胡萝卜素协同五氟尿嘧啶对食管鳞癌的抗肿瘤作用及机制研究

发布时间：2017-12-22 00:27

  本文关键词：β-胡萝卜素协同五氟尿嘧啶对食管鳞癌的抗肿瘤作用及机制研究　出处：《郑州大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：食管鳞癌是我国乃至世界范围内较为常见的恶性肿瘤,其致死率在我国高居第四位。据报道,接受手术治疗的食管鳞癌病人总体五年生存率不足20%。目前,化学治疗已成为肿瘤常规治疗的主要方法之一。但是,长期使用化疗药物,如五氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-FU),会造成肿瘤细胞的耐药性,并且正常细胞及组织也会受到相当程度的损害,肿瘤患者不得不因为这些损害而放弃继续化疗。因此,如何在保证正常组织减轻或免受化疗药物毒副作用的前提下,提高肿瘤细胞对化疗的敏感性,是目前恶性肿瘤基础研究和临床治疗的一个亟需解决的难题。近期大量体内外研究发现,天然化合物协同化疗药物使用不仅可以减轻化疗药物对细胞的毒副作用,同时还能提高肿瘤细胞凋亡率。因此,寻找低毒高效且作用靶点广泛的抗肿瘤天然化合物已成为抗肿瘤研究的热点之一。β-胡萝卜素是一种具有重要生理功能的共轭多烯烃类化合物,广泛存在于绿色植物、水果、蔬菜中。β-胡萝卜素作为维生素A的前体,在人体内可以转化为两分子维生素A,在细胞生长和分化过程中发挥重要作用。流行病学研究证实,经常食用富含β-胡萝卜素的蔬菜及水果能够有效降低各种癌症的发生率。研究表明,β-胡萝卜素具有抗氧化、清除活性氧自由基等功能,并且其抗肿瘤作用可能与其调节细胞内氧化还原状态有关。近期研究表明,β-胡萝卜素可以通过多种机制抑制不同肿瘤细胞的增殖,包括乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤以及前列腺癌等。然而,目前有关β-胡萝卜素对食管鳞癌作用的研究报道较少,此外,β-胡萝卜素能否与5-FU发挥协同抗癌作用呢?针对以上问题,本课题探讨β-胡萝卜素单独或联合5-FU的体内外抗食管鳞癌作用及其相关机制,为β-胡萝卜素与5-FU联合用药治疗食管鳞癌奠定理论基础。本课题主要分为两部分:第一部分:以食管鳞癌TE1、EC1、Eca109及正常食管上皮细胞Het-1A为研究对象,筛选β-胡萝卜素作用于食管鳞癌细胞的最优浓度及时间,并探讨β-胡萝卜素对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移的影响及其分子机制;第二部分:以食管鳞癌Eca109细胞及其裸鼠体内移植瘤为体内外研究对象,探讨β-胡萝卜素与5-FU联合的抗肿瘤作用及其相关机制研究。方法1.体外检测药物对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、周期、迁移的影响及其机制探讨CCK-8法检测细胞增殖,筛选出药物作用于食管鳞癌细胞的最佳浓度及时间。药物处理后,通过流式细胞术检测细胞周期的变化,Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡的变化,利用Transwell小室法检测细胞迁移能力的变化,实时荧光定量PCR检测小窝蛋白-1(caveolin-1,Cav-1)在m RNA水平表达,Western Blot方法检测细胞粘附因子E-cadherin、细胞周期蛋白Cyclin D1及Cav-1/AKT/NF-κB信号通路相关蛋白等的表达水平变化。2.β-胡萝卜素联合5-FU对裸鼠体内移植瘤的抗肿瘤作用及机制研究皮下注射Eca109细胞建立食管鳞癌荷瘤裸鼠模型,待肿瘤体积至100~200mm3,将裸鼠随机分为四组,即阴性对照组、β-胡萝卜素治疗组、5-FU治疗组、联合治疗组,每两天给药一次连续治疗三周,通过测量荷瘤鼠体重及肿瘤块体积变化判断β-胡萝卜素联合5-FU对荷瘤鼠的毒副作用以及对荷瘤鼠的治疗效果。TUNEL法检测肿瘤组织中Eca109细胞的凋亡水平,免疫组化检测肿瘤中PCNA、Bax、Bcl-2、Caspase-3的表达水平,HE染色检测裸鼠心肝脾肺肾等组织病理学变化。结果第一部分β-胡萝卜素对食管鳞癌细胞的影响及其机制初步研究1.β-胡萝卜素对食管鳞癌细胞增殖、凋亡、周期和迁移的影响β-胡萝卜素能够有效抑制食管鳞癌细胞的增殖,且具有时间及剂量依赖性。其中,30μMβ-胡萝卜素作用TE1细胞48 h后,细胞生长抑制率达到50%以上,50μMβ-胡萝卜素作用EC1和Eca109细胞48 h后,细胞生长抑制率均达到50%。而β-胡萝卜素对正常食管上皮细胞Het-1A并无生长抑制作用。与对照组相比,β-胡萝卜素能够显著促进食管鳞癌细胞株TE1、EC1和Eca109的凋亡(P0.05),且将细胞周期阻滞在G0/G1期(P0.05),明显降低周期蛋白Cyclin D1蛋白的表达(P0.05),并且能够降低细胞的迁移能力(P0.05)。此外,粘附因子E-cadherin蛋白表达水平较对照组显著提高。2.β-胡萝卜素抑制食管鳞癌细胞增殖的机制探讨实时荧光定量PCR检测发现,Cav-1在m RNA水平表达下调,Western Blot结果表明,Cav-1/AKT/NF-κB信号通路中Cav-1、p-AKT(Ser473)、p-NF-κBp65(Ser536)和Bcl-2蛋白表达水平降低,促凋亡因子Bax、Caspase-3表达上调。第二部分β-胡萝卜素联合5-FU对食管鳞癌细胞增殖的影响及其机制初步探讨1.β-胡萝卜素联合5-FU对食管鳞癌Eca109细胞增殖、凋亡、周期和迁移的影响CCK-8法检测细胞增殖发现,30μM 5-FU联合30μMβ-胡萝卜素组合处理细胞36 h后对Eca109的协同抑制率为60%±3.17%,而二者单独作用抑制率分别为40%±2.03%、22%±3.01%。β-胡萝卜素单独及联合5-FU处理后,Eca109细胞的G0/G1期的细胞比例增加明显增加,S期细胞比例减少,且差异显著(P0.05)。同时,细胞明显出现凋亡特征:体积皱缩,与周围细胞分离,形态不规则或变圆,而药物联合组细胞凋亡率明显高于单独用药组和对照组。此外,与单独作用组相比,药物联合组能够更有效地降低细胞迁移能力并提升粘附因子E-caherin的表达。2.β-胡萝卜素联合5-FU抑制食管鳞癌Eca109细胞增殖的机制初步探讨Western Blot检测发现,Cav-1/AKT/NF-κB信号通路中Cav-1、p-AKT(Ser473)、p-NF-κBp65(Ser536)和Bcl-2蛋白表达水平降低,促凋亡因子Bax、caspase-3表达上调,且联合处理组效果明显高于β-胡萝卜素或5-FU单独作用组。3.β-胡萝卜素联合5-FU的体内抗肿瘤作用治疗三周后,测量的肿瘤体积大小及重量分别是:对照组,(1198±156)mm3(0.38±0.08)g;β-胡萝卜素组,(949±92)mm3,(0.28±0.01)g;5-FU组,(652±88)mm3,(0.20±0.05)g;β-胡萝卜素联合5-FU组,(408±61)mm3,(0.12±0.03)g。与对照组相比,β-胡萝卜素组或5-FU组肿瘤体积及重量均明显减小,β-胡萝卜素联合5-FU组与单独处理组相比差异显著(P0.05)。免疫组化检测发现,与对照组相比,β-胡萝卜素组或5-FU组中Bax/Bcl-2比率、PCNA及Caspase-3表达水平较对照组差异性显著(P0.01);而β-胡萝卜素联合5-FU组中Bax/Bcl-2比率、PCNA及Caspase-3表达水平较单独处理组具有显著性差异(P0.01)。TUNEL检测结果显示,与对照组(5.02±0.81%)相比,β-胡萝卜素(12.15±1.44%)及5-FU单独处理组(23.03±2.67%)中Eca109细胞凋亡率明显升高,具有统计学意义(P0.01);而联合组细胞凋亡率(38.61±2.45%)较单独处理组明显升高(P0.01)。HE染色检测结果表明,连续治疗裸鼠三周后,药物并没有引起裸鼠各组织病理学变化。结论:1.β-胡萝卜素能够抑制食管鳞癌细胞增殖,促进细胞凋亡,并将细胞阻滞在G0/G1期,初步分析其可能通过调节Cav-1/AKT/NF-κB信号通路的活性发挥其细胞增殖的抑制作用。2.体外研究表明,联合使用β-胡萝卜素能够降低5-FU使用量,二者能够发挥协同抗肿瘤效应,且协同抑制Cav-1/AKT/NF-κB信号通路的活性。3.体内研究表明,β-胡萝卜素能够增强5-FU对食管鳞癌移植瘤生长的抑制作用,促进癌细胞凋亡。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1

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本文编号：1317771