未折叠蛋白反应相关信号分子在DLBCL中的表达及意义的研究

发布时间：2017-12-22 05:06

本文关键词：未折叠蛋白反应相关信号分子在DLBCL中的表达及意义的研究　出处：《浙江大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：未折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPR)是一种细胞自我保护性应答反应。在细胞遭受影响蛋白质折叠的不利条件时,错误折叠与未折叠蛋白质在内质网腔内聚集,影响细胞的正常生理功能。UPR通过增加细胞蛋白质折叠能力,重塑分泌通路以适应生长需要和环境改变,使细胞功能恢复正常并使之存活。近年来的研究提示,UPR通路的活化在B细胞正常发育或恶性转化过程中起着重要作用。研究发现,某些UPR信号分子的活化能诱导B淋巴瘤细胞启动保护性自噬,促进细胞的存活；也有研究表明UPR相关基因PRDM1在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)ABC亚型中扮演肿瘤抑制因子的角色。因此,关于UPR在DLBCL中的研究尚存争议。本研究旨在对UPR相关分子和下游活化通路进行整合分析,探索其在DLBCL发生、发展中的作用及与DLBCL预后的相关性,为DLBCL的预后评估和治疗提供科学依据。首先,我们通过免疫组织化学法检测两个重要的UPR通路分子IRE1α和PERK磷酸化蛋白(IRE1α-pS724和PERK-pT981)的表达水平。我们发现,在实验组DLBCL临床组织样本中IRE1α-pS724, PERK-pT981的中/高度表达水平分别为78.57%(121/154)和66.88%(103/154),明显高于对照组正常淋巴组织样本的36.67%(11/30)和23.33%(7/30)。通过对DLBCL患者进行临床特征回顾性分析和预后随访,截止至2015年10月31日,中位随访时间为39月(1月-65月)有71例患者死亡,病死率为46.10%。预后分析显示, IRE1α-pS724和PERK -pT981高表达可能是患者预后不良的指标(P=0.0054,P=0.0386)。接下来,采用免疫印迹法分别对实验组8株DLBCL细胞系和对照组正常健康捐赠者的外周血B淋巴细胞,进行UPR相关分子BiP, ATF6, IRE1α, PERK以及它们的磷酸化蛋白表达水平的检测。我们发现,上述UPR相关分子在DLBCL细胞株中的表达水平均高于普通B细胞。由此可知,在DLBCL细胞中存在UPR通路的基本活化。进而,我们用ERS诱导剂毒胡萝卜素(TG)刺激DLBCL细胞OCI-LY10和SU-DHL-4,发现在DLBCL细胞系中,ATF6, IREla, PERK和eIE2a的磷酸化蛋白表达水平随着TG刺激时间(0h,12h,24h,36h)的增加而持续升高。通过流式细胞仪检测细胞凋亡实验,发现TG刺激并不能诱导DLBCL细胞发生凋亡,但相同处理能够诱导对照组细胞HEK293发生凋亡,同时免疫印迹结果提示,HEK293细胞中UPR下游信号分子ATF4和促凋亡分子CHOP的表达水平升高。通过CO-IP试验,我们发现TG处理组和对照组细胞中ATF6-BiP、IREla-BiP以及PERK-BiP复合物均不发生解离；共聚焦显微镜下ATF6, p-IRE1α, p-PERK三者和Bip共定位。根据以上结果,我们构建了ATF6, IRE1α和PERK慢病毒敲低载体,分别感染OCI-LY10和SU-DHL-4细胞。我们发现,TG刺激能诱导ATF6, IRE1α敲低的细胞发生凋亡；PERK敲低的细胞,TG刺激对其凋亡并无明显诱导作用；将ATF6和IRE1α敲低的细胞稳株,再次进行PERK敲低,则TG组细胞凋亡率比PERK未敲低时明显下降。免疫印迹结果提示,ATF6或IRE1α敲低的细胞,TG刺激后ATF4和CHOP的表达水平明显增高；ATF6或IREla和PERK双敲低的细胞,TG刺激后ATF4和CHOP的表达水平比对照组略有增高,但差异并不明显。综上所述,在DLBCL中存在UPR信号通路的持续活化,该通路的活化不依赖于ERS的诱导,且能对抗ERS诱导的细胞凋亡。在对抗ERS诱导的DLBCL细胞凋亡中,ATF6和IRE1α信号分子起重要作用,促进肿瘤细胞的存活,具体分子调控机制还有待进一步探索。PERK激活的CHOP途径则在诱导细胞凋亡中发挥关键作用。本研究还发现,IREla和PERK的高活化水平可能是DLBCL患者预后不良的指标。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.1

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