血清候选标志物SAA1和FCN3的发现与验证
本文关键词：血清候选标志物SAA1和FCN3的发现与验证 出处：《广西医科大学》2016年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：随着分子生物学理论和实验技术的迅速发展,生物标志物的研究成为一个非常热门的研究领域。通过对关键生物大分子的测量和分析,有助于疾病的早期诊断或判断疾病的分期,为改善疾病的诊疗及预后提供新思路。生物标志物的研发包括发现/鉴定、验证和临床多中心确认三个步骤。在候选蛋白标志物的发现和鉴定阶段,组学技术是筛选差异表达基因或蛋白的重要方式,联合多组学技术同时在基因水平和蛋白水平层面分析和筛选疾病差异表达因子,是近年来研究的热点；在血清潜在蛋白标志物的验证阶段,需要至少两种不同的方法重复验证且要求验证结果表达趋势一致。一些传染病由于疾病的特殊性及条件的限制,使得血清潜在标志物的验证目前难以在细胞和动物模型中完成,质谱多反应监测(multiple reaction monitoring, MRM)技术为这一类问题提供解决方案。基于MRM质谱检测方法,无需制备抗体,检测成本低、通量高,一次可以检测多个目标蛋白,在生物标志物的验证环节中显示了较大的优越性,也被认为是利用质谱技术验证标志物的金标准。为此,本研究尝试联合转录组学和定量蛋白组学方法及MRM策略,分别筛选与验证肝癌和涂阴结核病血清差异表达蛋白,并探讨血清淀粉样蛋白A1 (serum amyloid A1, SAA1)和纤维胶凝蛋白3 (ficolin 3, FCN3)分别作为肝癌和涂阴肺结核的血清候选标志物的可能性。第一部分基于多组学策略发现肝癌血清潜在标志物并验证SAA1目的：联合转录组学和定量蛋白组学方法发现肝癌细胞株和肝癌血清的共同差异表达因子,并分析SAA1作为肝癌血清候选标志物的可能性。方法：通过转录组学技术筛选出肝癌细胞(Smmc-7721)和正常肝细胞(HL-7702)的差异表达基因,然后筛选出同时与肝癌转移和炎症相关的差异表达基因。采用定量蛋白组学方法筛选10例健康对照者和10例肝癌患者血清的差异表达蛋白,且筛选出同时与肝癌转移和炎症相关的差异表达蛋白。然后联合两种组学数据发现共同差异表达因子；RT-PCR验证差异因子在肝癌细胞和正常肝细胞的表达水平；收集107例血清(52例健康对照者血清,55例肝癌患者血清,13例肝癌转移患者血清)进行ELISA验证；构建受试者工作特征曲线(ROC),并进行分析。结果：转录组测序发现7个基因同时与肝癌转移和炎症相关；定量蛋白组学发现14个蛋白与肝癌转移和炎症相关。联合转录组学和蛋白组学发现共同与肝癌转移和炎症相关的差异表达蛋白SAA1。 RT-PCR验证结果显示：肝癌细胞中SAA1蛋白的mRNA水平是正常肝细胞的3.14倍(P0.0001)。ELISA验证结果显示肝癌转移组、肝癌非转移组和健康对照组血清中SAA1的含量分别为53.24±22.84μg/mL、34.08±19.89μg/mL和25.23±13.58μg/mL,肝癌转移组血清中SAA1的含量显著高于非转移组(P0.01),而肝癌组的血清SAA1的含量也显著高于健康对照组(P0.01)。肝癌转移与非转移之间的ROC曲线下面积0.850(P0.001),鉴别肝癌转移的灵敏度和特异度分别是84.6%和81.0%。肝癌和正常对照之间的ROC曲线下面积0.680(P0.01),鉴别肝癌的灵敏度和特异度分别是63.6%和53.8%。结论：联合转录组学和定量蛋白质组学是一种有效的血清蛋白标志物的探索方法；炎症因子SAA1蛋白可能参与肝癌的发生和转移,值得进一步进行临床多中心验证。第二部分基于MRM策略验证涂阴肺结核血清蛋白标志物FCN3目的：基于MRM策略验证涂阴肺结核潜在蛋白标志物,并分析FCN3作为涂阴肺结核血清蛋白标志物的可能性。方法：采集10例健康对照者血清,10例肺炎患者血清和10例涂阴肺结核患者血清,严格参照MRM质谱检测的操作流程,优化质谱检测条件,同时对酸性糖蛋白2抗体(A1AG2)、凝血因子9(FA9)、玻连蛋白(VTN)、血清淀粉样蛋白A4 (SAA4)和纤维胶凝蛋白3(FCN3)等5个涂阴肺结核潜在血清标志物进行相对定量分析；对与前期血清蛋白组学筛选结果一致而且分析结果较好的蛋白FCN3进一步ELISA验证,对FCN3诊断涂阴肺结核的ROC曲线进行分析。结果：MRM技术在血清中检测到5个肺结核候选血清标志物对应的鉴定肽段,分离效果和色谱峰形均满足分析要求。相对定量结果显示5个候选血清蛋白质均在各组的涂阴肺结核组中蛋白水平均显著低于正常对照(P0.05)。ELISA分析发现FCN3在涂阴肺结核、肺炎和健康对照三组血清的浓度分别为1060.71±196.10 ng/m1、1219.63±246.34 ng/ml和1267.24± 260.10 ng/ml,涂阴肺结核中的表达水平显著降低(P=0.001),结果与MRM验证结果一致,ROC曲线分析显示示曲线下面积和临界值分别是0.929(P0.001)和1152.03ng/ml,诊断涂阴肺结核的灵敏度和特异度分别是85.61%和82.52%。结论：MRM质谱检测技术通量高,能同时检测多个目标蛋白,在血清标志物的验证中具有潜力。多个验证结果均显示FCN3在涂阴肺结核血清中表达降低,FCN3作为涂阴肺结核候选血清标志物有一定的应用价值。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7;R521
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，本文编号：1320430
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