分子靶向药物17-AAG和RO3280在急性髓系白血病中的作用及其机制研究

发布时间：2017-12-22 19:08

  本文关键词：分子靶向药物17-AAG和RO3280在急性髓系白血病中的作用及其机制研究　出处：《苏州大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：第一部分HSP90选择性抑制剂17-AAG可诱导急性髓系白血病细胞的凋亡目的：研究热休克蛋白90(HSP90)抑制剂17-AAG对急性髓系白血病(AML)细胞株的凋亡诱导作用及分子机制,为后续的临床研究提供重要依据。方法：17-AAG以依次递增的浓度处理AML细胞株HL60和NB4 24小时后,使用CCK-8比色法检测细胞活性；采用Annexin V-FITC/PI凋亡试剂盒在流式细胞仪上检测细胞的凋亡；采用PI染色流式细胞术分析细胞周期。利用Western blot方法检测凋亡相关蛋白PARP和Caspase-3的表达和活化状态。5μM 17-AAG处理NB4细胞24小时后,利用凋亡芯片PAHS-3012检测17-AAG处理组与DMSO对照组的370个凋亡相关基因的表达变化情况。结果：17-AAG可浓度依赖性地抑制HL60和NB4细胞的增殖,细胞周期试验表明,17-AAG加药组细胞被阻滞于G2/M期,且随着时间和／浓度的增加,细胞周期发生紊乱。Annexin V-FITC/PI流式凋亡结果表明,随着药物处理浓度的增加,细胞凋亡水平增加,其中NB4细胞凋亡率：DMSO对照组6.0％4±0.5％,17-AAG 5μM组36.5%±2.2％,17-AAG 10μM组46.9%±3.2%；HL60细胞凋亡率：DMSO对照组2.7%±0.7%,17-AAG 5μM组16.7％±2.6％,17-AAG 10μM组30.8%±1.6%。5μM和101μM处理NB4细胞24小时后,c-PARP的表达量随着浓度的增加而增加,但未检测到c-Caspase-3的表达。PCR Array结果表明：17-AAG处理NB4细胞后,与对照组相比,凋亡相关的370多个基因中,有56个基因显著上调,23个基因显著下调。结论：17-AAG可抑制急性髓系白血病细胞的增殖,诱导细胞的凋亡以及阻滞周期于G2/M期。并且,这些作用是通过多种凋亡相关基因的改变共同实现的。第二部分肿瘤蛋白PLK1的新型分子靶向抑制剂：R03280诱导急性髓系白血病细胞凋亡的作用及机制研究目的：探讨Polo样激酶1(PLK1)抑制剂R03280对人类急性髓系白血病细胞的凋亡诱导作用及分子机制,为后续的临床实验提供重要依据。方法：Western Blot法检测PLK1在白血病细胞株、AML病人和正常人骨髓中的蛋白表达,RT-PCR法检测PLK1在105例儿童AML病人和30例非白血病病人标本中的mRNA表达。应用CCK-8比色法观察不同浓度RO3280、Rigosertib (ON 01910. Na)以及B12536处理AL细胞株24小时的生长抑制作用,同时检测R03280对原代细胞的生长抑制作用。50nM、00nM RO3280处理白血病细胞株24小时后,采用Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒在流式细胞仪上检测细胞的凋亡,碘化丙啶染色后流式细胞术分析细胞周期,Hoechst 33342荧光染色法观察药物处理前后细胞核的形态变化。Western blot检测凋亡相关蛋白PARP、Caspase-3和Caspase-9的表达和活化状态。采用SABioscience公司的凋亡芯片PAHS-3012检测R03280处理组与DMSO组的370个凋亡相关基因的表达变化情况,并验证候选基因的蛋白表达。结果：Western blot结果表明：PLK1蛋白在白血病细胞株中均有较高水平的表达,在儿童AML的骨髓样本中表达率达73.3%(11/15),而正常骨髓标本表达很低甚至不表达；在mRNA水平上,AML病人的PLK1表达水平明显高于对照组(106×Log 2(-ΔCt):82.95 ± 110.28 vs.6.36 ± 6.35;p 0.001)0细胞增殖抑制实验表明,R03280可剂量依赖性地抑制白血病细胞株及AML原代细胞的增殖,其在白血病细胞株中的IC50值为74 nM到797nM之间,而在AML原代细胞的IC50值在35.49-110.76 nM之间；三种PLK1抑制剂分别处理白血病细胞株24小时后,检测各组IC50值为：NB4细胞R0328013.45 nM, ON 01910. Na 13.02 nM, BI253687.65 nM, K562细胞：RO3280301 nM, ON 01910. Na 1606 nM, BI2536 448 nM,与另外两种抑制剂相比R03280在HL60与NB4细胞中的作用最敏感。Annexin V凋亡流式结果表明,R03280处理细胞24小时后,加药组细胞较对照组凋亡水平明显增加,提示R03280可诱导白血病细胞的凋亡;细胞周期结果表明,R03280可阻滞细胞在G2/M期,其中有些细胞随浓度增加出现周期紊乱现象；Hoechst 33342染色后,可观察到R03280处理组的异常细胞核及DNA碎片；以50nM和100nM RO3280处理NB4和HL60细胞24小时后,c-PARP、c-Caspase3、 c-Caspase9的表达量随着浓度的增加而增加。PCR-Array结果显示：与对照组相比,R03280处理NB4细胞组有32个基因明显上调,16个基因明显下调。其中上调基因DCC,CDKN1A在蛋白水平也显著上调,下调基因BTK和SOCS2在蛋白水平也显著下调。结论：R03280可高效抑制急性白血病细胞的增殖,诱导其凋亡和阻滞细胞在G2/M期,该作用可能通过多个凋亡相关基因的改变共同实现的。
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R733.71

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本文编号：1320647