骨肉瘤干细胞的分选及恶性表型的鉴定

发布时间：2017-12-24 03:09

  本文关键词：骨肉瘤干细胞的分选及恶性表型的鉴定　出处：《第三军医大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：研究背景根据肿瘤干细胞(cancer stem cells,CSCs)理论,肿瘤实体由大量的具有异质性、异构的细胞群构成。肿瘤干细胞是顶层次结构的亚群,通过对称和不对称的分裂实现肿瘤实体的增加,干细胞能够自我更新和产生其余的肿瘤细胞。与正常人体干细胞不同的是,肿瘤干细胞的扩散、增殖是失控的。与正常人体干细胞相同的是,它维持基因组的完整性、具有自我更新能力、多向分化潜能。随着肿瘤干细胞理论的提出,生物医学方面的研究人员相继从白血病、肺癌、脑肿瘤、结肠肿瘤、肝癌等多个恶性肿瘤中分选出了肿瘤干细胞,并在肿瘤干细胞的生物学性状描述上做了大量工作。随着研究的深入,逐渐发现肿瘤干细胞所具有的独特生物学特性,并发现其在肿瘤发生、恶性生长、转移、耐药等多个方面扮演着重要角色。在骨肉瘤的相关研究中,国内外学者相继从骨肉瘤MG-63、U2OS细胞株中分选出肿瘤干细胞,并进行了一定程度的生物学研究,发现了其CSCs在细胞表面标记、生长方式、生物学性能等方面与非CSCs的差异,提示骨肉瘤和其他肿瘤一样,同样存在CSCs。然而,作为骨肉瘤家族中恶性程度高(高成瘤、高转移率)的骨肉瘤143-B细胞株,却未见相关报道。为了进一步研究骨肉瘤CSCs的生物学性能,我们以骨肉瘤143-B细胞株为研究对象,对其进行CSCs的分选,并观察其生物学特性。第一部分有限稀释法分选骨肉瘤143-B干细胞目的:探索骨肉瘤干细胞的分选方法,为进一步研究骨肉瘤的生物学特性打下基础。方法:购自中国典型培养物保藏中心的143-B细胞株进行常规培养、传代,取生长良好的细胞进行软琼脂克隆分选、SP分选、有限稀释法分选,将分选出的细胞进行扩增、传代,同样传至第二代后提取RNA并进行相对定量PCR比较其干性因子Nanog、OCT4的表达。结果:软琼脂克隆法分选出的细胞在Nanog、OCT4的表达上与亲代细胞143-B无显著差异。有限稀释法及SP分选法分选出的细胞在Nanog、OCT4的表达上高于亲代细胞143-B并差异显著,而有限稀释法与SP法分选出的细胞两者之间无明显差异。结论:有限稀释法可有效分选出肿瘤干细胞,并且在Nanog、OCT4的表达上与SP分选法分选出的肿瘤干细胞无显著差异。第二部分143-B细胞株干细胞的生物学性能目的:探索骨肉瘤143-B细胞株干细胞的生物学性能,进一步了解骨肉瘤并为治疗骨肉瘤、提高骨肉瘤患者的生活质量、生存时间提供初步实验依据。方法:1、成球试验收集143-B、143-L(有限稀释法所得到的骨肉瘤143-B细胞株干细胞)二组细胞,并计数,按照一定浓度接种在无血清软琼脂孔板中,观察细胞球形成。2、蛋白印迹法(Western-Blot)分析收集143-B、143-L、143-SP(SP分选法分选骨肉瘤143-B细胞株所得到的肿瘤干细胞)三组细胞,并裂解三组细胞提取总蛋白,以BCA蛋白浓度测定试剂盒测定三组细胞的总蛋白浓度,Western-Blot检测三组细胞中Nanog、OCT4的表达情况并进行比较。3、免疫荧光法检测细胞干性标志物表达将143-B、143-L细胞以相同浓度接种在爬片上,待细胞生长至铺满爬片60%左右面积时,给予4%多聚甲醛固定,进行免疫荧光检测Nanog、OCT4在143-B、143-L中的表达情况并进行比较。4、细胞多向分化潜能潜能的检测收集143-B、143-L细胞并计数,以相同浓度接种在12孔孔板中,分别进行成骨诱导分化试验、成脂、成软骨诱导分化试验,观察两组细胞在成骨分化、成脂、成软骨分化的能力并进行比较。5、细胞耐药能力(顺铂、阿霉素)的检测收集143-B及143-L细胞,以相同浓度将细胞接种在96孔细胞培养板内,次日换液后加入含有不同浓度顺铂的培养基,24小时后加入细胞计数试剂盒-8(cell counting kit-8,CCK-8)试剂并在酶标仪上测定96孔细胞培养板每孔在450nm处的吸光度(D)值,根据吸光度(D)值及添加的顺铂浓度绘制耐药曲线,并在耐药曲线上标出顺铂对该细胞的半数抑制浓度(half inhibitory concentration IC50)。并比较细胞存活数量,进而比较其对顺铂的耐药能力。6、动物成瘤试验比较两组细胞在裸鼠体内的成瘤能力将体重、周龄无显著差异的18只裸鼠随机分为6组,143-B及143-L细胞各按照三个剂量组(1×106、1×105、1×104),每个剂量组皮下注射三只裸鼠,定期测量瘤体生长情况及裸鼠体重变化情况,并将两组细胞相同剂量进行比较。7、统计学处理应用SPSS 17.0软件对所得数据进行处理,确定试验所得结果统计学上有意义。结果:1、143-L具有较143-B更强的成球能力。结果具有统计学意义。2、143-L、143-SP较143-B具有更高的Nanog、OCT4蛋白表达。143-L与143-SP在Nanog、OCT4蛋白表达上两者之间无显著差异。免疫荧光检测Nanog、OCT4表达,143-L较143-B同样显著增高。结果具有统计学意义。3、在相同的诱导分化条件下,143-L细胞具有较强的向成骨细胞分化的能力,143-B细胞向成骨分化能力较弱;143-L细胞具有较强的向脂肪细胞分化能力,143-B不能向脂肪细胞分化;143-L具有向软骨细胞分化的能力,143-B细胞在诱导阶段即不能形成细胞团块。4、顺铂对143-B的半数抑制浓度约为0.83ug/m L,对143-L的半数抑制浓度约为2.51ug/m L。表明143-L较143-B具有更强的对顺铂耐药能力。阿霉素对143-B的半数抑制浓度约为0.11 ug/m L,对143-L的半数抑制浓度约为0.25ug/m L。表明143-L较143-B具有更强的对顺铂、阿霉素耐药能力。5、143-L及143-B两组细胞经过接种在裸鼠体内5周后,143-L细胞在1×105剂量组、1×106剂量组均成瘤,1×104剂量组未能成瘤;而143-B细胞在1×106剂量组、1×105剂量组、1×104剂量组均未能成瘤。结论:经有限稀释法分选出的肿瘤干细胞,显著高表达干性因子Nanog、OCT4,具有较亲代细胞更强的自我更新能力,具有多向分化潜能,符合肿瘤干细胞的基本特征。且肿瘤干细胞在对肿瘤化疗药物的耐受性方面,远远强于亲代细胞。异体成瘤能力上,远远强于亲代细胞。
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1

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