吲哚美辛对白血病细胞增殖和细胞衰老的影响

发布时间：2017-12-24 03:34

本文关键词：吲哚美辛对白血病细胞增殖和细胞衰老的影响　出处：《山西医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:近年来,有研究发现环氧化酶-2(COX-2)在包括白血病在内的多种恶性肿瘤中表达增强,并认为其表达与肿瘤细胞的增殖、黏附等作用相关。而非甾体类抗炎药物可以抑制环加氧酶(cyclooxygenase,COX)的活性,因而可能对肿瘤产生抑制作用。本研究通过观察吲哚美辛对白血病细胞体外增殖与细胞衰老的影响,以分析非甾体类抗炎药物对白血病是否有辅助治疗作用。方法:1.细胞培养及分组干预实验选用三种常见的白血病细胞株(U266、K562、U937),将三种细胞株接种于含10%胎牛血清(FBS)的IMDM培养基中,置37℃、5%CO?培养箱中培养,取对数生长期细胞用于后续实验。调整每个培养基中细胞浓度为104/ml,以终浓度为30μM的吲哚美辛分别处理三种细胞作为干预组,以加入相同体积吲哚美辛的溶剂DMSO作为对照组。2.细胞增殖抑制的台盼蓝拒染法检测取对数生长期的三种细胞以培养液调整细胞浓度为104/ml接种于24孔培养板中,以终浓度为30μM的吲哚美辛分别处理三种细胞作为干预组,以不加药组作为对照组,每组设4个平行孔。分别培养0、4、7天后收集细胞,离心并重悬制备成单细胞悬液,进行台盼蓝染色,5min内用血球计数板分别计算死亡细胞数和活细胞数。光镜下观察,未染色的为活细胞,染成淡蓝色的则为死亡细胞。活细胞率(%)=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)x100%。3.细胞周期测定取各组细胞以104/ml密度按前述分组培养三种细胞系。PBS清洗一次,加入70%冰乙醇置于4℃冰箱固定过夜。按照细胞周期测定说明书要求标记细胞,用流式细胞仪测定细胞周期各时相细胞比率的变化。4.细胞凋亡检测依据上述条件调整细胞密度后分组培养。用Annexin V-FITC/PI法检测收集培养4天后的各组细胞。1000rpm离心5min,用冰PBS洗涤一遍后,再用分析缓冲液清洗一遍,重悬制备成单细胞悬液。按照试剂盒说明书操作标记细胞,上流式细胞仪检测。5.细胞衰老测定如上所述分组培养0、4、7天后收集细胞。用PBS清洗一遍,按照细胞衰老检测试剂盒说明书操作检测,光镜下观察计数衰老细胞数。衰老细胞率(%)=衰老细胞总数/(衰老细胞总数+正常细胞总数)x100%。6.增殖抑制基因p21、p27m RNA水平变化的RT-PCR检测以培养液调整细胞浓度为104/ml,采用上述分组培养细胞4天后,按High Pure PCR Product Purification试剂盒说明书操作,提取RNA,分光光度计定量。根据Ta Ka Ra公司m RNA Selective PCR试剂盒说明书采用一步法RT-PCR进行扩增反应。各种引物序列用Premier5.0软件设计,以GAPDH作为内参。结果:1.吲哚美辛对三种细胞系细胞活率的影响加药培养0、4、7天后使用台盼蓝拒染法检测结果显示,U266、U937吲哚美辛干预组细胞活率与对照组相比降低,差异有统计学意义(P0.05)(图1-1,图1-3),提示终浓度为30μM的吲哚美辛对U266、U937细胞增殖有抑制作用;对K562的抑制作用与对照组相比无明显差异(P0.05)(图1-2)。2.对细胞周期的影响流式细胞术检测显示,与对照组相比U266、U937的吲哚美辛处理组G2/M期细胞比例显著增加,差异有统计学意义(P0.05)(图1-4,图1-6),这提示吲哚美辛可影响U266、U937细胞的周期分布,使U266、U937细胞发生G2/M期阻滞;K562细胞的周期分布与对照组相比差异无统计学意义(P0.05)(图1-5)。3.对细胞凋亡的影响检测结果显示,U266、K562、U937对照组的凋亡率分别为(0.30±0.18)%、(0.31±0.19)%、(0.20±0.12)%;给予吲哚美辛干预后,细胞凋亡率分别升高为(3.10±0.42)%、(1.40±0.21)%、(1.38±0.10)%。与对照组相比,差异有统计学意义(P0.05)。提示吲哚美辛诱导U266、K562、U937细胞凋亡的发生(图1-7)。4.对细胞衰老的影响与对照组相比,吲哚美辛处理组K562、U937细胞衰老率增高显著,差异有统计学意义(P0.05)(图1-9,图1-10),U266细胞衰老率变化不明显(P0.05)(图1-8)。提示吲哚美辛可以诱导K562、U937细胞衰老。5.对增殖抑制基因p21和p27 m RNA水平的影响RT-PCR检测表明,在加药培养4天后,三种细胞株(U266、K562、U937)的p21m RNA水平均有所增高,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05)(图1-11)。分组培养4天后与对照组相比,U266、K562的p27m RNA水平也显著增高,差异有统计学意义。而U937的p27m RNA水平与对照组相比无统计学差异(P0.05)(图1-12)。结论:吲哚美辛可以对白血病细胞的生长和增殖产生抑制作用,但其机制可因白血病细胞的种类不同而异。除抑制白血病细胞增殖,增加细胞凋亡外,吲哚美辛可引起多发性骨髓瘤U266细胞、单核细胞白血病U937细胞发生细胞周期阻滞,而对U937细胞和慢性髓系白血病细胞K562可以同时促进其细胞衰老过程。提示非甾体类抗炎药物可对白血病起辅助治疗作用,但需根据白血病的类型适当选择。
【学位授予单位】：山西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R733.7

【参考文献】