大肠癌相关成纤维细胞的放射效应与大肠癌细胞相互影响的研究

发布时间：2017-12-26 18:37

  本文关键词：大肠癌相关成纤维细胞的放射效应与大肠癌细胞相互影响的研究　出处：《苏州大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的初步研究肿瘤细胞对大肠癌相关成纤维细胞(CCAFs)放射效应的影响,以及辐照后大肠癌相关成纤维细胞对大肠癌细胞的影响。方法采用组织块培养法,将组织块周爬出的成纤维细胞消化,培养至3-4代,免疫荧光鉴定后,与大肠癌细胞共培养并分四组,依次为①非共培养0Gy组②共培养0Gy组③共培养4Gy组④非共培养4Gy组,处理各组后,检测CCAFs的生长、凋亡、自噬以及衰老等放射反应。收集CCL-244/CCAFs共培养(CCAFs组)以及CCL-224/辐照CCAFs共培养(RCCAFs组)条件培养基,并以无血清培养基培养的CCL-224细胞作为空白组,检测各组肿瘤细胞CCL-244的克隆、增殖、生长、迁移能力。结果CCAFs和CNFs都表达成纤维细胞标志物Vimentin;CCAFs表现为α—SMA表达阳性,而CNFs几乎不表达α—SMA;无论共培养与否,辐照组CCAFs的生长活力(OD值)均小于非辐照组(P0.05),而进行4Gy辐照后,共培养4Gy组与非共培养4Gy组的生长活力在第2、4天无明显差别(P0.05),但在第6天时,两者OD值出现统计学差异,表现为共培养4Gy组的OD值高于非共培养4Gy组,未辐照的CCAFs的生长活力(OD值)是逐渐增加的,而接受辐射后,无论在共培养组还是非共培养组与否,CCAFs的生长活力(OD值)几乎没有变化;与大肠癌细胞(HCT及CCL)共培养的CCAFs,经4Gy辐照后,凋亡率明显增加(P0.01),非培养4Gy组CCAFs的凋亡率高于与共培养4Gy组(P0.01);非共培养4Gy组CCAFs经过辐照后,出现明显的染色反应,细胞数目变少,但细胞体积变大,衰老染色深,而在与大肠癌细胞共培养的CCAFs经过4Gy辐照,亦出现染色反应,但染色细胞数量少,相对染色较浅(p0.01),且未出现明显的细胞形态学改变;通过对自噬相关蛋白Atg-5、Atg-7和Beclin-1表达的Western blot检测,可见经4Gy辐照后,各组CCAFs的自噬有关蛋白表达增加,辐照后,非共培养4Gy组的CAFs的自噬水平明显高于共培养组。RCCAFs组的肿瘤细胞克隆增殖比为0.6589±0.009493,高于CCAFs组(0.6378±0.01365),但差异无统计学意义(P0.05),两组均明显高于空白组(0.5200±0.006939),差异具有统计学意义(P0.01);RCCAFs组反应肿瘤细胞生长能力的吸光度值(OD值)在第3天和第5天分别为0.3502±0.1278和0.6571±0.1351,CCAFs组分别为0.3234±0.00986和0.7116±0.1259,均明显高于空白组(0.2258±0.00536)和(0.4608±0.1382),差距具有统计学意义(P0.01),但在第3天RCCAFs组的OD值高于CCAFs组差别无统计学意义(P0.05),第5天RCCAFs组的OD值低于CCAFs组差别有统计学意义(P=0.007);RCCAFs组肿瘤细胞增殖指数(PI)为0.4203±0.01308,低于CCAFs组(0.4491±0.01916),差异无统计学意义(P0.05),两组均明显高于空白组(0.3381±0.02580),差异具有统计学意义(P0.05);RCCAFs组的迁移率在48h为(39.33±3.80)%,CCAFs组为(40.12±4.04)%,两组间差异无统计学意义(P0.05);均高于空白组(21.13±2.89)%,差异有统计学意义(P0.01)。结论CCAFs对辐射并不具有超强耐受力,4Gy单次辐照即可对CCAFs产生生长抑制、凋亡增加、明显衰老和自噬等效应;大肠癌细胞对CCAFs具有一定放射保护作用。4Gy单次辐射并未影响CCAFs对大肠癌CCL-224促生长、增殖与迁移能力。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of tumor cells on the radiation effects of colorectal cancer associated fibroblasts (CCAFs) and the effect of colorectal cancer related fibroblasts on colorectal cancer cells after irradiation. Methods using tissue culturing method, tissue fibroblasts digested into block weeks climbed out, cultured 3-4, immunofluorescence, and colorectal cancer cells were cultured and divided into four groups, followed by non 0Gy co culture group of co culture group 0Gy 4Gy co culture group and the non 4Gy co culture group after each treatment, the detection of CCAFs, growth, apoptosis, autophagy and aging radiation reaction. CCL-244/CCAFs co culture (group CCAFs) and CCL-224/ irradiated CCAFs co culture (RCCAFs group) conditioned medium were collected, and CCL-224 cells cultured in serum-free medium were used as blank group. The ability of cloning, proliferation, growth and migration of tumor cells in each group was detected. The results of CCAFs and CNFs expression of fibroblast marker Vimentin; CCAFs showed a - SMA positive expression, and there was almost no expression of CNFs alpha - SMA; both co culture or not, the viability of the irradiation group CCAFs (OD) were less than that of non irradiated group (P0.05), and after 4Gy irradiation, 4Gy co culture the co culture group and non growth activity 4Gy group had no significant difference in the second, fourth day (P0.05), but on the sixth day, there was a significant difference between the two values, performance for the OD value of 4Gy group was higher than that of non 4Gy co culture group co culture, the growth vigor of unirradiated CCAFs (OD) is gradually increasing, and accept after irradiation, both in the co cultured group and non coculture group or not, the growth activity of CCAFs (OD) almost no change; and colorectal cancer cells (HCT and CCL) were cultured by CCAFs after 4Gy irradiation, the apoptosis rate was obviously increased (P0.01), non training group 4Gy CCAFs the apoptosis rate was higher than that of co culture with 4Gy Group (P0.01); co culture group 4Gy CCAFs after irradiation, appear obvious staining reaction, cell number reduced, but the cell volume change, aging dyeing depth, while in coculture with colon cancer cells CCAFs after 4Gy irradiation, there were staining reaction, but staining small numbers of cells, the staining was relatively shallow (P0.01), and no significant morphological changes; the autophagy related protein Atg-5, Atg-7 and Beclin-1 expression of Western blot detection, visible 4Gy irradiation, the expression levels of CCAFs protein increased autophagy, autophagy after irradiation, non co culture group 4Gy CAFs was significantly higher than that in the co culture group. RCCAFs group of tumor cell clone proliferation ratio was 0.6589 + 0.009493, higher than that of group CCAFs (0.6378 + 0.01365), but the difference was not statistically significant (P0.05), the two groups were significantly higher than the control group (0.5200 + 0.006939), the difference was statistically significant (P0.01); RCCAFs group was absorbance of tumor cell growth ability (the value of OD) were 0.3502 + 0.1278 and 0.6571 + 0.1351 in third days and fifth days, CCAFs group were 0.3234 + 0.00986 and 0.7116 + 0.1259, was significantly higher than the control group (0.2258 + 0.00536) and (0.4608 + 0.1382), with significant difference (P0.01), but in third days the OD value of RCCAFs group was higher than that of the CCAFs group had no significant difference (P0.05), the OD value of fifth days RCCAFs group than in the CCAFs group had significant difference (P=0.007); RCCAFs group of tumor cell proliferation index (PI) was 0.4203 + 0.01308, lower than that of group CCAFs (0.4491 + 0.01916), the difference was not statistically significant (P0.05, two) Group was significantly higher than the control group (0.3381 + 0.02580), the difference was statistically significant (P0.05); migration rate of RCCAFs group at 48h (39.33 + 3.80)%, group CCAFs (40.12 + 4.04)%, there was no significant difference between the two groups (P0.05); higher than the control group (21.13 + 2.89%), the difference was statistically significant (P0.01). Conclusion CCAFs does not have strong tolerance to radiation. 4Gy can increase growth inhibition, increase apoptosis, senescence and autophagy effect on CCAFs by single irradiation. Colorectal cancer cells have a certain radioprotective effect on CCAFs. Single radiation of 4Gy did not affect the growth, proliferation and migration of CCAFs on colorectal cancer CCL-224.
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.34

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