CGI-58对5-FU诱导肿瘤相关巨噬细胞凋亡的影响及机制研究

发布时间：2017-12-29 19:14

  本文关键词：CGI-58对5-FU诱导肿瘤相关巨噬细胞凋亡的影响及机制研究　出处：《第三军医大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：肿瘤微环境中的巨噬细胞(肿瘤相关巨噬细胞TAM)的存活有利于肿瘤的恶性发展[3,4,5,52],而化疗能附带杀死TAM起辅助疗效。研究TAM对化疗的敏感性,对于探索肿瘤的化疗抵抗机制具有重要意义。5-FU是黑色素瘤、结肠癌、头颈部肿瘤等恶性实体肿瘤的常用化疗药物[1,2],但它对TAM的杀伤作用尚不明确。在前期实验中,我们发现结肠癌TAM中脂质分解代谢显著增强,提示TAM的存活和功能活性依赖于旺盛的能量代谢[54],干预TAM的物质能量代谢,可能会影响5-FU对TAM的杀伤敏感性[54],使5-FU等化疗对TAM的杀伤作用更明显。在前期实验中我们又发现:巨噬细胞中的CGI-58能够促进脂肪分解和线粒体的耗氧,抑制活性氧ROS的生成,提示CGI-58可能会影响5-FU对巨噬细胞的杀伤作用[54]。前期研究表明:脂肪分解代谢的关键基因CGI-58在结肠癌TAM中显著升高[6];而CGI-58又是是调节线粒体功能的重要因子[7],提示TAM可能抵抗5-FU的杀伤作用,进而导致化疗效果不佳。我们首先在体外用CCK-8法检测了5-FU处理普通巨噬细胞(PLKO)与CGI-58特异性敲低的巨噬细胞(CGI-58-KD)的细胞增殖能力,通过流式细胞术检测5-FU诱导的PLKO与CGI-58-KD的细胞周期与凋亡,Western Blot检测其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表达水平,Seahorse Assays检测其线粒体功能并用活性氧阻断剂NAC进行了回复实验,结果发现CGI-58缺失会促进5-FU对巨噬细胞增殖活力的抑制作用,主要是通过促进5-FU诱导的巨噬细胞凋亡而对其周期阻滞无显著影响,并且会损伤巨噬细胞的线粒体功能,导致ROS聚集,而清除ROS后CGI-58缺失促进5-FU对巨噬细胞杀伤活性的效应消失。基于上述体外研究的发现我们进一步在体内进行了验证。我们在体内用成功构建的CGI-58过表达的转基因小鼠黑色素瘤移植瘤模型检测了5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤生长和预后的影响,并分别用巨噬细胞去除剂和活性氧ROS抑制剂NAC干预后检测了5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤生长和预后的影响,结果发现TAM可以抵抗5-FU的化疗效果,使预后变差,并且巨噬细胞CGI-58过表达会抵抗5-FU对肿瘤的杀伤作用,而清除ROS后CGI-58过表达抵抗5-FU杀伤肿瘤的效应增强。以上结果表明CGI-58缺失可促进5-FU对巨噬细胞的杀伤作用,而CGI-58过表达可抑制5-FU对巨噬细胞的杀伤作用;CGI-58对5-FU诱导的巨噬细胞杀伤敏感性的影响,主要是通过影响凋亡而非周期阻滞;CGI-58影响5-FU对巨噬细胞的杀伤作用是通过影响巨噬细胞ROS的产生来实现的;CGI-58通过影响TAM中的线粒体功能,抑制ROS生成,促进黑色素瘤TAM对5-FU的抵抗作用,进而减弱5-FU对肿瘤的化疗效果,导致肿瘤恶性进展,预后不佳。因此,以CGI-58为切入点从TAM脂质分解代谢的角度来阐明CGI-58对5-FU诱导的TAM凋亡的影响及其作用机制,研究结果对于探索提高5-FU等化疗药物对肿瘤的疗效有重要的指导意义。目的:研究CGI-58对5-FU诱导的肿瘤相关巨噬细胞凋亡的影响及其作用机制。方法:一、离体实验考察CGI-58抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用及机制1.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞增殖能力的影响为了研究CGI-58抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用,我们在体外用CCK-8法检测了5-FU处理PLKO与CGI-58-KD的细胞增殖活力。2.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞周期的影响为了研究CGI-58抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用机制,我们首先在体外通过流式细胞术检测了5-FU处理的PLKO与CGI-58-KD的细胞周期,观察不同处理条件下G1期的细胞比例。3.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞凋亡的影响为了研究CGI-58缺失5-FU诱导的巨噬细胞凋亡的影响,我们在体外通过流式细胞术检测了5-FU处理的PLKO与CGI-58-KD的细胞凋亡,并用Western Blot检测了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表达水平。4.CGI-58缺失对巨噬细胞线粒体功能的影响为了进一步研究CGI-58抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用机制,我们又在体外对PLKO与CGI-58-KD的线粒体功能进行了检测,通过Seahorse检测了其基础耗氧率OCR,生物发光法检测了其ATP生成量,荧光法检测了其活性氧ROS的生成情况。5.清除ROS后CGI-58缺失对巨噬细胞线粒体功能及5-FU诱导的巨噬细胞增殖和凋亡的影响为了验证上述效应机制我们用活性氧抑制剂NAC做了回复实验,NAC阻断处理后在体外通过荧光法检测了PLKO与CGI-58-KD的ROS的生成情况,CCK-8法检测了5-FU处理的PLKO与CGI-58-KD的细胞增殖能力及Western Blot检测了其凋亡蛋白(Cleaved Caspase-3)的表达水平。二、在体实验考察肿瘤相关巨噬细胞CGI-58对5-FU化疗效果的抵抗作用1.CGI-58转基因小鼠的构建(TG~(CGI-58))我们用Western Blot鉴定了CGI-58过表达的转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)腹腔原代巨噬细胞及其他组织器官的CGI-58的表达水平。2.移植瘤(黑色素瘤)型中,去除巨噬细胞后5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤预后的影响在体内给转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)皮下接种黑色素瘤后给予5-FU和巨噬细胞去除剂(氯膦酸二钠脂质体)处理,动态检测小鼠的体重和生存期。3.移植瘤(黑色素瘤)模型中,5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤生长和预后的影响在体内给转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)皮下接种黑色素瘤后给予5-FU化疗,动态检测小鼠的体重、肿瘤生长情况及生存期。4.移植瘤(黑色素瘤)模型中,清除ROS后5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)的肿瘤生长和预后的影响用活性氧抑制剂NAC阻断处理后在体内通过皮下移植瘤(黑色素瘤)实验动态检测5-FU化疗后转基因(TG~(CGI-58))小鼠和野生型(WT)小鼠的体重、肿瘤生长情况及生存期。结果:(一)离体实验考察CGI-58抵抗5-FU对巨噬细胞的杀伤作用及机制1.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞增殖能力的影响5-FU处理后,CGI-58-KD比PLKO细胞的增殖能力明显降低,说明CGI-58缺失会促进5-FU对巨噬细胞增殖活力的抑制作用。2.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞周期的影响5-FU处理后CGI-58-KD与PLKO细胞的G1期细胞比例无明显差异,说明CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞周期阻滞无显著影响。3.CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞凋亡的影响5-FU处理后,CGI-58-KD比PLKO的凋亡细胞的比例明显增加,且凋亡蛋白Caspase-3的表达水平明显升高,说明CGI-58缺失会促进5-FU诱导的巨噬细胞凋亡。4.CGI-58缺失对巨噬细胞线粒体功能的影响与PLKO相比,CGI-58-KD细胞的OCR降低、ATP减少、ROS增多,揭示CGI-58缺失会损伤巨噬细胞的线粒体功能,导致ROS聚集。5.清除ROS后CGI-58缺失对巨噬细胞线粒体功能及5-FU诱导的巨噬细胞增殖和凋亡的影响ROS抑制剂NAC阻断后,CGI-58-KD与PLKO细胞的ROS生成基本一致,5-FU处理的CGI-58-KD与PLKO细胞的增殖能力无明显差异,且凋亡蛋白Caspase-3的表达水平也无差异,说明清除活性氧(ROS)可消除CGI-58缺失对巨噬细胞线粒体功能的损伤和CGI-58缺失促进5-FU对巨噬细胞增殖活力的抑制作用以及CGI-58缺失对5-FU诱导的巨噬细胞凋亡增加,综上提示我们清除ROS后CGI-58缺失促进5-FU对巨噬细胞杀伤活性的效应消失(二)在体实验考察肿瘤相关巨噬细胞CGI-58对5-FU化疗效果的抵抗作用1.CGI-58转基因小鼠的构建(TG~(CGI-58))只在腹腔原代巨噬细胞中转基因小鼠(TG~(CGI-58))的CGI-58的表达水平明显高于野生型小鼠(WT),说明转基因小鼠(TG~(CGI-58))构建成功。2.移植瘤(黑色素瘤)型中,去除巨噬细胞后5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤预后的影响将巨噬细胞去除后5-FU处理的转基因小鼠(TG~(CGI-58))与野生型小鼠(WT)的体重和生存期均无明显差异,说明转基因小鼠(TG~(CGI-58))较之野生型小鼠(WT),5-FU化疗预后差,但是巨噬细胞去除后,可消除这种差异,且预后变好,提示TAM抵抗5-FU对肿瘤的化疗效果,使预后变差。3.移植瘤(黑色素瘤)模型中,5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)肿瘤生长和预后的影响5-FU处理后转基因(TG~(CGI-58))小鼠比野生型(WT)小鼠的体重轻、肿瘤生长快,生存期变短,说明巨噬细胞CGI-58过表达会抵抗5-FU对肿瘤的杀伤作用,预后变差。4.移植瘤(黑色素瘤)模型中,清除ROS后5-FU对转基因小鼠(TG~(CGI-58))和野生型小鼠(WT)的肿瘤生长和预后的影响ROS抑制剂NAC阻断后,5-FU处理的转基因小鼠(TG~(CGI-58))与野生型小鼠(WT)的体重、肿瘤生长情况和生存期也无明显差异,并且均比转基因小鼠(TG~(CGI-58))+5-FU组的预后更差,这说明转基因(TG~(CGI-58))小鼠较之野生型(WT)小鼠,5-FU化疗预后差,而清除活性氧(ROS),不但可以消除上述这种差异而且巨噬细胞CGI-58过表达抵抗5-FU杀伤肿瘤的效应也增强。结论:1.CGI-58缺失促进5-FU对巨噬细胞的杀伤作用,而CGI-58过表达抑制5-FU对巨噬细胞的杀伤作用。2.CGI-58对5-FU诱导的巨噬细胞杀伤敏感性的影响,主要是通过影响其凋亡而非周期阻滞。3.CGI-58影响5-FU对巨噬细胞的杀伤作用是通过影响巨噬细胞ROS的产生来实现的。4.巨噬细胞CGI-58抑制ROS生成,促进黑色素瘤TAM对5-FU的抵抗作用,进而减弱化疗效果,使预后变差。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R730.5

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