载脂蛋白E影响巨噬细胞因子表达及分型的机制研究

发布时间：2017-12-30 14:18

本文关键词：载脂蛋白E影响巨噬细胞因子表达及分型的机制研究　出处：《河北医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:巨噬细胞作为固有免疫的第一道屏障,能通过诱导T细胞募集和活化来促进适应性免疫,对外来病原体的防御、清除和直接杀伤肿瘤细胞并提呈肿瘤相关抗原起着至关重要的作用。在不同细胞因子构成的微环境影响下,巨噬细胞分化为不同的功能表型。M1型巨噬细胞具有杀灭细菌和肿瘤细胞的能力;M2型巨噬细胞则具有组织修复和促进肿瘤细胞增殖、侵袭及抑制T细胞与自然杀伤细胞免疫活性等能力。M1型和M2型巨噬细胞数量上是一种动态平衡,若失衡则会导致病理性疾病的发生。因此,随着探讨极化巨噬细胞抑制和促进肿瘤进展的双重作用机制的不断深入,本课题为将来的基因治疗提供重要的实验依据。载脂蛋白E(Apolipoprotein E,Apo E)是一种分子量为35k Da的糖蛋白,其m RNA广泛表达于肝脏、肾脏、肺脏、脾脏、皮肤、脑和各种细胞(如巨噬细胞、卵巢颗粒细胞),主要功能是调节血浆蛋白、脂蛋白的运输及代谢过程。大量文献提示,Apo E参与肿瘤的发展过程,与肝细胞株相比,肝癌细胞株Hep G2中Apo E蛋白水平显著增加,但Apo E在卵巢癌细胞中的表达增加却预示预后良好。这些结果表明,Apo E在人类肿瘤中的作用并不一致,究竟是什么原因导致Apo E的作用有如此大的不同?肿瘤细胞分泌的前列腺素E2(PGE2)是肿瘤微环境中一种重要的因子,其抑制活化巨噬细胞中CCL5 m RNA和蛋白的表达。炎症和炎性介质是肿瘤微环境的重要贡献者。为此,本研究利用LPS和PGE2模拟肿瘤微环境,以小鼠巨噬细胞株RAW264.7为模型,通过建立高表达Apo E的RAW264.7细胞株,研究Apo E在肿瘤微环境下对RAW264.7细胞细胞因子分泌、功能表型分化的影响,以期为肿瘤免疫治疗提供新的理论视角。方法:1应用Lipofectamine 2000瞬时转染Apo E,建立高表达Apo E细胞株,SYBR Green荧光染料法实时定量PCR检测Apo E的表达。2实时定量PCR检测瞬时转染Apo E的RAW264.7细胞IL-1β、TNF-α、IL-6、IL-10和i NOS m RNA表达;利用流式细胞仪检测巨噬细胞表面标志分子CD86和CD206表达情况。3 Western blot检测与炎症、增殖等MAPK相关蛋白(P-p38、P-ERK 1/2)的表达。结果:1构建了高表达Apo E的瞬时转染RAW264.7细胞株,SYBR Green荧光染料法实时定量检测Apo E的表达,结果显示,与RAW264.7细胞株相比,Apo E表达水平增高5.1±0.4倍,具有统计学意义。2实时定量PCR检测活化巨噬细胞炎性细胞因子表达,结果显示,与对照组相比,在RAW264.7细胞和高表达Apo E RAW264.7细胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表达均增加,但高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6表达增高倍数明显低于RAW264.7细胞,差异有统计学意义。3实时定量PCR检测PGE2刺激后巨噬细胞炎性细胞因子的表达,结果显示,与RAW264.7细胞相比,高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表达降低,差异有统计学意义。4实时定量PCR检测PGE2刺激活化巨噬细胞炎性细胞因子的表达,结果显示,与对照组相比,在RAW264.7细胞和高表达Apo E RAW264.7细胞株中,IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA表达明显增加,但高表达Apo E RAW264.7细胞株中IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10表达增加倍数明显低于RAW264.7细胞,差异有统计学意义。5实时定量PCR检测Apo E m RNA表达,结果显示,与对照组相比,LPS刺激巨噬细胞后Apo E m RNA表达降低,而PGE2则促进LPS刺激活化的巨噬细胞中Apo E m RNA表达明显增加,差异有统计学意义。6实时定量PCR检测i NOS m RNA表达,结果显示,与对照组相比,在野生型小鼠BMDMs细胞中,LPS刺激细胞后,i NOS m RNA表达增高,而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs细胞中,LPS刺激后,i NOS m RNA表达则降低;PGE2刺激活化巨噬细胞后,野生型和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs细胞中i NOS m RNA表达均增高,但Apo E基因敲除型小鼠BM-DMs细胞i NOS表达增高的倍数高于野生型小鼠BMDMs,差异有统计学意义。7利用流式细胞技术检测BMDMs细胞表面CD86和CD206分子表达情况,结果显示,在野生小鼠BMDMs细胞中,与对照组相比,LPS刺激巨噬细胞后,CD86和CD206均升高,而LPS和PGE2同时刺激细胞时,CD86和CD206分子表达均降低;而在Apo E基因敲除小鼠BMDMs细胞中,LPS刺激后,CD86分子升高,而CD206分子降低,LPS和PGE2同时刺激细胞时,则CD86和CD206分子表达均降低,且降低程度低于野生组,差异有统计学意义。8 Western blot结果显示,与对照组相比,野生型小鼠和Apo E基因敲除型小鼠BMDMs细胞在LPS刺激下,P-p38、P-ERK1/2增加;PGE2刺激则P-p38、P-ERK1/2降低;LPS和PGE2共同刺激时,P-p38增加,P-ERK1/2降低,但Apo E基因敲除型小鼠BMDMs p38、ERK1/2磷酸化程度明显高于野生型小鼠,差异有统计学意义。结论:1 Apo E在PGE2刺激活化巨噬细胞中抑制IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-10 m RNA的表达。2 PGE2促进活化巨噬细胞中Apo E m RNA表达。3 Apo E在PGE2刺激活化巨噬细胞中抑制i NOS m RNA的表达,抑制细胞向M1型巨噬细胞分化。4 Apo E在PGE2刺激活化巨噬细胞中抑制CD86分子表达,促进CD206分子表达,即促进巨噬细胞向M2型细胞分化。5 PGE2刺激活化巨噬细胞使Apo E表达增加是通过p38和ERK1/2信号转导途径实现的。
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【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R730.3

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