对急性髓系白血病患者及HL-60细胞株中白血病干细胞的研究
发布时间：2018-01-07 07:18
本文关键词：对急性髓系白血病患者及HL-60细胞株中白血病干细胞的研究 出处：《昆明医科大学》2015年硕士论文 论文类型：学位论文
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【摘要】：[目的]研究急性髓系白血病(AML)患者中白血病干细胞(Leukemia stem cell, LSC)的表达情况,以及三氧化二砷(As2O3)对HL-60细胞株中干细胞的作用,探讨白血病干细胞与疾病的预后关系,寻找干预白血病干细胞的治疗的新思路。[方法]免疫磁珠分选法分选AML患者骨髓中单个核细胞CD34+、 CD34+/CD123+细胞,流式细胞仪检测分选前、后阳性细胞的表达率,结合临床资料进行分析。免疫磁珠分选法分选HL-60细胞株中CD34+ CD34+/CD123+细胞群,设置不同浓度As2O3对分选后CD34+细胞群作用24h、48h和72h,采用改良MTS法检测药物对细胞的增殖抑制作用；Annexin V-FITC/PI双染法及PI单染法流式细胞仪检测As2O3对CD34+细胞群细胞周期及凋亡、坏死的影响；MS-PCR法检测CD34+细胞群ID4、CDH13、SFRP2基因甲基化情况,观察A8203的去甲基化作用。[结果]1.20名AML患者中普遍表达CD34+、CD34+/CD123+,未分选前CD34+的表达率为32.92±30.16%,CD34+/CD123+的表达率为10.70±12.13%,采用免疫磁珠标记分选后CD34+的表达率为74.87±10.49%,CD34+/CD123+的表达率为68.29±12.99%；分选后CD34+的表达率、CD34+/CD123+的表达率均比分选前高(P0.05),磁珠分选后阳性细胞富集效果明显,可得到纯度较高的细胞群。CD34+的得率为21.77±8.27%,CD34+/CD123+的得率为16.35±3.52%。磁珠分选法所得细胞数量较少,对后续研究造成困难。2.CD34+抗原的表达率,初治组为28.63+25.44%,难治复发组为67.72±22.04%,完全缓解组为4.74±7.64%；CD34+/CD123+抗原的表达率,初治组为10.84±9.51%,难治复发组为23.41±10.01%,完全缓解组为2.91±6.25%。经统计学分析,CD34+抗原的表达率,难治复发组高于初治组和完全缓解,初治组高于完全缓解组、低于难治复发组,两两对比差异有统计学意义(P0.05)；CD34+/CD123+的表达率,难治复发组高于完全缓解组,差异有统计学意义(P0.05),初治组与完全缓解组、难治复发组间对比差异无统计学意义(P0.05)。3.HL-60细胞株中分选前CD34+的表达率为4.06±2.11%,CD34+/CD123+的表达率为1.65±0.79%；分选后CD34+的表达率为72.8±12.58%,CD34+/CD123+的表达率为12.67±0.071%；分选后阳性细胞经条件培养1周后CD34+的表达率为80.71±5.43%,CD34+/CD123+的表达率为11.04±1.25%。分选后、培养1周的细胞比分选前CD34+的表达率高,差异有统计学意义(P0.05)；分选前、后及培养1周后CD34+/CD123+的表达率低,差异无统计学意义(P0.05)。4.用不同浓度的A8203干预HL-60细胞株以及分选后CD34+细胞群24h、48h、72h后,有明显的增殖抑制作用,以72h12umol/1最显著,具有时效和量效关系。5.HL-60细胞株中CD34+细胞群大部分处于G0/G1期(87.7%),低浓度的AS2O3可诱导HL-60细胞株中CD34+细胞群进入细胞周期(S期为主),2umol/172时处于S期和G2/M期细胞数量最多(51.4±2.80%),随着浓度的提高,G0/G1期逐渐增多,S期细胞先增加、后减少,G2/M期无明显规律。当72h 12umol/1时,As2O3主要以阻滞细胞处于GO/G1期为主(84.21±3.42%)。6.As2O3对HL-60细胞株分选后的CD34+细胞群有促进凋亡和坏死的作用,以72h12umol/1最甚,作用呈现明显的时效和量效依赖的关系。As203作用于HL-60细胞株分选后的CD34+细胞群,无论作用时间长短及药物浓度高低,细胞均以凋亡为主。7.用MS-PCR法检测HL-60细胞株中ID4、CDH13、SFRP2基因甲基化情况,ID4基因可以扩增出甲基化和非甲基化条带,判定为甲基化阳性；CDH13基因可以扩增出甲基化条带,判定为甲基化阳性；SFRP2基因可以扩增出甲基化条带和非甲基化条带,判定为甲基化阳性。不同浓度As2O3对HL-60细胞株中CD34+细胞群作用72h后,ID4、CDH13基因仍然存在甲基化。[结论]1.20例AML患者的骨髓标本普遍表达CD34+、CD34+/CD123+,表达率从低到高不等。CD34+/CD123+表达率在难治复发组高于完全缓解组,在一定程度上可以反映病情的进展,高表达提示预后不良,并且可以据此用来评估LSC的数量及增殖情况。经过磁珠分选后CD34+、CD34+/CD123+的表达率明显提高。免疫磁珠分选法耗时短、操作简便,对细胞损伤不大,是获得白血病患者骨髓中含量稀少的白血病干细胞的有效方法。2.HL-60细胞株中存在CD34+、CD34+/CD123+细胞群,所占比例均较低；采用免疫磁珠标记分选后CD34+的表达率明显提高,CD34+/CD123+的表达率仍较低。分选后与培养1周后的CD34+细胞表达率对比无明显差异,该群细胞的特性相对稳定。As2O3对HL-60细胞株中CD34+细胞群有抑制增殖和促进凋亡、坏死的作用,呈明显的时效和量效关系。HL-60细胞株中CD34+细胞群大多数处于G0/G1期,低浓度的As2O3能诱导CD34+细胞群进入细胞周期(S期为主)；高浓度的As2O3能阻滞CD34+细胞群于G0/G1期。3.HL-60细胞株中CD34+细胞群ID4基因、SFRP2基因和CDH13的甲基化阳性。As2O3对HL-60细胞株中CD34+细胞群去甲基化作用不明显。
[Abstract]:[鐩殑]鐮旂┒鎬ユ，
本文编号：1391530
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