热休克蛋白Mortalin在肝癌细胞中的作用及其机制研究

发布时间：2018-01-10 14:10

  本文关键词：热休克蛋白Mortalin在肝癌细胞中的作用及其机制研究　出处：《昆明医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

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【摘要】：目的：通过慢病毒基因转载抑制热休克蛋白Mortalin的表达,并用western blot检测其与四跨膜蛋白CD151在肝癌细胞中的相互关系,以及对磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信号通路的影响,并研究其对肝癌细胞迁移和侵袭的影响。方法：1.通过吉满生物科技(上海)有限公司,体外利用easy RNAi慢病毒构建技术将干扰Mortalin合成依次标记为TRAP1、TRAP2、TRAP3的三个靶点序列基因分别用载体PGMLV-SC5 (2494):hU6-MCS-CMV-ZsGreen 1-PGK-Puro进行包装,转染至人肝癌细胞株HepG2中,转染细胞组标记为TRAP1细胞组、TRAP2细胞组、TRAP3细胞组,通过荧光表达率和western blot技术,选取TRAP1细胞组、TRAP2细胞组、TRAP3细胞组3组细胞中,转染效率最高即Mortalin表达下降最多的细胞组作为接下来的实验细胞组。然后再运用western blot技术比较未进行转染人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组),未携带靶点序列病毒颗粒转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(阴性对照组)和Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(实验组),三组细胞中CD151的表达情况。2. 由第一部分实验筛选出的Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(实验组)与未进行转染人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组),通过用western blot实验检测其PI3K/AKT信号通路中的关键蛋白：蛋白激酶B(AKT)及磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)的表达,讨论Mortalin下调对HepG2细胞中PI3K/AKt信号通路的影响。3.分别应用划痕实验和Transwell小室检测抑制Mortalin表达后人肝癌细胞HepG2的迁移能力与侵袭能力的改变情况。结果：1.用于抑制Mortalin表达的三个靶点序列TRAP1、TRAP2、TRAP3转染的三组人肝癌细胞HepG2中,TRAP2序列转染的人肝癌细胞HepG2 (TRAP2细胞组)中Mortalin的表达下降最明显,并设为接下来实验的实验组。未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组),未携带靶点序列病毒颗粒转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(阴性对照组)和Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(实验组),通过Western blot进行比较后,CD151的表达未见明显下调,统计学无差异。2. Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(TRAP2细胞组)与未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组相比较, PI3K/AKT信号传导通路中AKT略有下调,但是不明显,无统计学差异。P-AKT随Mortalin表达下降有所下调,有明显差异,具有统计学意义。3. Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(TRAP2细胞组)作为实验组、未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组为空白组对照组,未携带靶点序列病毒颗粒转染的人肝癌细胞HepG2细胞组为阴性对照组。在Transwell室检测细胞侵袭能力实验中：将空白组与阴性对照组、实验组与阴性对照组、实验组与空白对照组,两两进行比较,实验组侵袭能力明显下将。在划痕实验中：在0小时,12小时,24小时,36小时四个时间段,对实验组与空白对照组划痕宽度进行比较,实验组迁移能力未见明显改变。结论：1.在人肝癌细胞中,抑制HepG2表达后,CD151表达未出现明显Mortalin下调,二者表达无相关关系。2. 抑制人肝癌细胞中HepG2的表达后,Mortalin信号传导通PI3K/AKT路中AKT无明显下调,说明的下调对人肝癌细胞Mortalin中总AKT量HepG2并不产生影响,而随P-AKT表达下降有所下调,差别明显,说明Mortalin的下调会引起人肝癌细胞Mortalin内HepG2信号传导通路中AKT磷酸化的下PI3K/AKT降,而这种差别并不是由于总AKT量的表达不等造成,是由于抑制人肝癌细胞中HepG2的表达后,会抑制AKT活化,从而抑制Mortalin信号传导PI3K/AKT通路的信号转导。3.在细胞侵袭实验中：未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组)与未携带靶点序列病毒颗粒转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(阴性对照组)侵袭细胞数无明显差异(p0.05),说明空载病毒本身并不会对人肝癌细胞HepG2的侵袭能力产生改变,未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组)侵袭细胞数较Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(TRAP2细胞组)实验细胞组侵袭有明显差异(p0.05),未携带靶点序列病毒颗粒转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(阴性对照组)侵袭细胞数较Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(TRAP2细胞组)实验细胞组侵袭也有明显差异(p0.05),与空白对照组和阴性对照组比较结果相符合。说明抑制人肝癌细胞HepG2中Mortalin的表达,对其体外侵袭能力有显著影响。在细胞迁移实验中：比较Mortalin表达下降最多的人肝癌细胞HepG2细胞组(TRAP2细胞组)实验细胞组与未进行转染的人肝癌细胞HepG2细胞组(空白对照组)在0小时,12小时,24小时,36小时划痕宽度,均无明显差异(p0.05),说明抑制Mortalin的表达,并不能抑制人肝癌细胞HepG2体外迁移能力。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of the heat shock protein ( Mortalin ) in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 by means of slow virus gene transfer , and to investigate its effects on the migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells . The method includes the following steps : 1 . The cells of the three target sequences labeled TRAP1 , TRAP2 , TRAP3 are labeled as TRAP1 , TRAP2 , TRAP3 by western blot . Results : 1 . The expression of Mortalin in HepG2 cells transfected with TRAP1 , TRAP2 and TRAP3 was significantly lower than that in HepG2 cells ( control group ) . The results showed that the expression of Mortalin in HepG2 cells transfected with three target sequences TRAP1 , TRAP2 and TRAP3 was significantly lower than that in HepG2 cells ( experimental group ) . Compared with the untreated human liver cancer cell line HepG2 cells , there was a slight downregulation in the signal transduction pathway of human liver cancer cells ( TRAP2 cells ) with the highest expression of Mortalin , but there was no statistical difference . In the experiment of invasion ability of human liver cancer cells , the expression of CD151 in the experimental group was significantly lower than that in the negative control group , the experimental group and the blank control group . There was no significant difference in the invasion ability of HepG2 cells ( P < 0.05 ) . The expression of Mortalin in HepG2 cell group ( control group ) was significantly lower than that in HepG2 cells ( control group ) .

【学位授予单位】：昆明医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.7

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本文编号：1405555