SIRT6调控Bax凋亡信号通路促进肝癌细胞凋亡逃逸

发布时间：2018-01-22 07:50

  本文关键词： 肝癌 SIRT6 凋亡 Bax　出处：《重庆医科大学》2015年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的：通过研究SIRT6调控Bax凋亡信号通路促进肝癌细胞凋亡逃逸,来探讨肝细胞肝癌的发生发展机制。方法：1.利用Western Blot和qRT-PCR检测SIRT6在101例肝癌病人和各种肝癌细胞系中的表达。Kaplan-Meier分析SIRT6与肝癌病人预后相关。2.利用慢病毒介导技术在肝癌细胞上沉默SIRT6基因的表达,WesternBlot验证SIRT6沉默效率；通过台盼蓝染色实验分析SIRT6基因沉默对肝癌细胞增殖的影响；平板集落实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞集落形成能力的影响；EdU标记实验检测SIRT6基因沉默对肝癌细胞DNA合成的影响；流式细胞计数和Western Blot检测SIRT6基因沉默对细胞凋亡的影响。3.在永生化的肝细胞MIHA上过表达SIRT6, WesternBlot验证SIRT6过表达是否成功；通过台盼蓝染色实验分析SIRT6对永生化肝细胞增殖的影响；软琼脂集落形成实验检测SIRT6对永生化肝细胞非锚定生长能力的影响；EdU标记实验检测SIRT6对永生化肝细胞DNA合成的影响；流式细胞计数和Western Blot检测SIRT6对永生化肝细胞凋亡的影响。4.利用qRT-PCR分析SIRT6沉默后肝癌细胞内凋亡相关基因mRNA水平的变化；继而使用Western Blot验证筛选出的凋亡相关蛋白的变化水平。利用免疫细胞化学和Western Blot分析Bax蛋白在SIRT6基因沉默后细胞定位的变化；利用台盼蓝染色实验检测沉默Bax基因对SIRT6基因沉默引起的肝癌细胞增殖的影响；利用流式细胞学和Western Blot检测沉默Bax对SIRT6基因沉默引起的肝癌细胞凋亡的影响。5.利用双荧光素酶报告系统分析Bax启动子的关键区域,并检测SIRT6基因沉默对Bax基因启动子的关键区域的影响；ChIP检测SIRT6对Bax启动子的关键区域组蛋白乙酰化位点的影响；ChIP进一步检测SIRT6基因沉默对Bax,启动子转录因子的影响。6.利用Western Blot检测SIRT6和Ku70在细胞质和细胞核中的定位；IP实验检测SIRT6与Ku70的相互关系。Western Blot检测缺失SIRT6对Ku70蛋白表达量的影响。IP实验检测SIRT6对Ku70乙酰化水平的影响；IP实验进一步检测SIRT6基因沉默对Ku70-Bax复合物的影响。7.在在荷氏移植瘤模型试验中验证SIRT6对肝癌细胞生长的影响。结果：1.在本研究中我们发现SIRT6在大量肝癌病人中表达明显增高,并且SIRT6增高与肝细胞肝癌病人不良预后(p=0.024)高度相关。同时发现SIRT6在肝癌细胞系上表达水平较永生化肝细胞MIHA和原代肝细胞PHH高。2.在多个肝癌细胞系上沉默SIRT6可以抑制肝癌细胞的增殖,并抑制肝癌细胞DNA合成和抑制肝癌细胞集落形成；沉默SIRT6可以诱导肝癌细胞凋亡。3.在永生化肝细胞上过表达SIRT6可以促进永生化肝细胞增殖,促进永生化肝细胞DNA合成和促进永生化肝细胞非锚定生长能力；SIRT6可以降低阿霉素诱导的凋亡。4.SIRT6可以通过Bax信号通路来发挥抗肝癌细胞凋亡作用。SIRT6缺失可以促进Bax从细胞核和细胞质向线粒体转位。沉默Bax可以拮抗SIRT6缺失引起的肝癌细胞凋亡。5.SIRT6被招募到Bax启动子上,通过去乙酰化组蛋白H3K9位点,抑制Bax启动子活性。在缺失SIRT6时,结合于Bax启动子上的转录因子p53和E2F-1明显增加。6.SIRT6、Bax和Ku70可以在细胞质中形成复合物,缺失SIRT6可以通过乙酰化Ku70促进Ku70-Bax复合物的分离,阻止Bax向线粒体转位。7.在荷氏移植瘤模型试验中发现SIRT6基因沉默可以抑制移植瘤的生长。结论：SIRT6在肝细胞肝癌形成中起着促进进用,因此针对SIRT6的治疗可能成为肝细胞肝癌治疗的一个靶点。
[Abstract]:Objective: through the cell apoptosis of SIRT6 on regulating the apoptosis of Bax signaling pathway to escape, to explore the mechanism of the occurrence and development of hepatocellular carcinoma. Methods: the expression of.Kaplan-Meier by Western Blot and qRT-PCR 1. SIRT6 was detected in 101 patients with hepatocellular carcinoma and hepatocellular carcinoma cell lines of SIRT6 and.2. in patients with hepatocellular carcinoma prognosis by lentivirus mediated expression of SIRT6 gene silencing in human hepatocellular carcinoma cells, WesternBlot verification of SIRT6 silencing efficiency; through the analysis of the influence of SIRT6 gene silencing by trypan blue staining on hepatocellular carcinoma cell proliferation experiment; colony assay of SIRT6 gene silencing colony forming ability of hepatoma cells; the effect of silencing SIRT6 gene detection EdU labeling experiments on the synthesis of DNA cells; gene silencing of SIRT6 detected by flow cytometry and Western effect of Blot on apoptosis of.3. in immortalized hepatocytes The expression of SIRT6 cell MIHA, WesternBlot verification SIRT6 overexpression was successful; trypan through analysis on the effect of SIRT6 on immortalized hepatocyte proliferation blue staining experiment; soft agar assay of SIRT6 immortalized hepatocyte non anchored growth ability; EdU marker assays of SIRT6 liver cells DNA the synthesis of eternal life; influence of flow cytometry and Western Blot detected SIRT6 of immortalized hepatocytes apoptosis of hepatoma cells by qRT-PCR.4. analysis of apoptosis related gene mRNA levels after SIRT6 silencing; changes in the level and then use Western Blot to verify the screened protein related apoptosis. Changes of Bax protein gene in SIRT6 cells silence after positioning by using immunocytochemistry and Western Blot; using trypan blue staining of hepatocellular carcinoma cells Bax gene silencing assay on SIRT6 induced gene silencing. 娈栫殑褰卞搷锛涘埄鐢ㄦ祦寮忕粏鑳炲�﹀拰Western Blot妫，

本文编号：1454128