肝细胞癌DCA敏感性差异的实验研究

发布时间：2018-01-29 01:30

  本文关键词： 代谢重编程 糖酵解 线粒体 OXPHOS PDK1 DCA　出处：《吉林大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：多种肿瘤细胞包括肝癌细胞表现出“有氧糖酵解”特性,即在有氧的条件下也依赖糖酵解产生ATP,同时,线粒体氧化磷酸化(OXPHOS)功能降低,肿瘤细胞的这种代谢重构现象称为“Warburg effect”。近来研究发现,肿瘤细胞的药物抵抗与糖代谢重构相关,由于不同肿瘤细胞代谢方式存在差异,有的研究推测肿瘤细胞的代谢改变可能与药物抵抗存在关系。丙酮酸脱氢酶激酶(PDK1)作为糖代谢的关键酶,在多数肿瘤细胞中高表达,且PDK1高表达的肿瘤预后较差。PDK1能够磷酸化丙酮酸脱氢酶(PDH)抑制其活性(因为PDH的抑制与“Warburg effect”相关),减少丙酮酸进入线粒体代谢,这被称为肿瘤细胞代谢重编程的重要部分。越来越多的研究证明PDK1在肿瘤细胞糖代谢中发挥了重要作用。DCA是PDK的小分子抑制剂,能够通过抑制PDK的活性进而活化PDH,使得代谢流由糖酵解转向线粒体有氧氧化,进而活化线粒体途径的凋亡。本研究组在对肝癌细胞进行实验研究时发现,PDK1在BEL-7402细胞中的表达明显高于HepG2细胞,且BEL-7402细胞对DCA敏感性较差,这提示肝癌细胞对PDK1的依赖程度与肿瘤药物抵抗间存在关系,但其具体机制尚不明确。本研究主要分析肝癌细胞HepG2和BEL-7402代谢方式差异,同时通过干扰肿瘤细胞糖代谢方式,诱导线粒体应激,增加细胞药物敏感性,为临床个体化治疗提供思路。实验方法:(1)MTT法检测DCA对HepG2和BEL-7402细胞活力的影响;流式细胞术检测细胞凋亡;Western Blot检测凋亡相关蛋白变化。(2)葡萄糖氧化法和比色法分别检测两株肝癌细胞外液中的葡萄糖和乳酸水平;q PCR检测糖酵解相关酶基因表达;比色法检测LDH酶活性;流式细胞术检测mROS及比色法检测柠檬酸的含量;Western Blot检测糖酵解蛋白的表达。(3)葡萄糖、乳酸试剂盒检测细胞葡萄糖摄取和乳酸生成的变化;实时定量PCR及Western Blot检测DCA对糖酵解相关酶基因及蛋白的影响;试剂盒检测LDH酶活性的变化;PCR及Western Blot检测缺氧诱导因子HIF-1α表达的变化。(4)流式细胞术检测m ROS及膜电势的变化;柠檬酸试剂盒检测线粒体内柠檬酸的产量变化;Mito Tracker染色后激光共聚焦观察线粒体形态的变化。(5)根据RNAi原理,构建sh-PDK1质粒并转染细胞,倒置荧光显微镜观察mROS的生成改变;分光光度法检测葡萄糖消耗和乳酸生成;流式细胞术检测细胞凋亡;PCR和Western Blot检测糖酵解相关基因和蛋白的表达。结果:(1)DCA以剂量依赖方式抑制HepG2细胞的活力并促进其凋亡;DCA 80m M时能够明显抑制BEL-7402细胞活力,但无明显促凋亡作用。(2)通过检测HepG2和BEL-7402细胞基础水平的糖代谢相关指标,发现BEL-7402细胞糖酵解相关基因及蛋白表达较高,细胞外液中乳酸水平及LDH活性也高于HepG2细胞,同时,线粒体ROS及柠檬酸盐含量低于HepG2细胞。(3)DCA能够抑制HepG2和BEL-7402细胞的葡萄糖摄取及乳酸生产,LDH活性及糖酵解相关因子HK2、LDHA、HIF-1α、GLUT1、GLUT4等蛋白和基因的表达,且对HepG2的抑制效果更为明显。(4)DCA能够明显诱导HepG2细胞线粒体内ROS和柠檬酸盐的生成,导致膜电势下降,BEL-7402细胞的变化则不明显。同时,DCA能够影响HepG2细胞线粒体的动力学,使其融合分裂平衡打破,但对BEL-7402细胞的作用并不明显。(5)敲除PDK1,能够明显降低HepG2细胞的细胞活力并促进其凋亡,并且能够抑制HepG2糖酵解相关基因及蛋白的表达,降低细胞外液葡萄糖及乳酸的生成,增加线粒体内ROS的生成;对于BEL-7402细胞,敲除PDK1不能导致细胞凋亡,并且没有明显改变Bel-7402细胞的糖代谢。实验结论:1.DCA能够抑制HepG2细胞糖酵解,恢复其线粒体氧化磷酸化功能,并增加线粒体途径的凋亡敏感性。2.BEL-7402细胞的糖代谢模式受DCA影响不显著,且其对DCA敏感性较低。3.BEL-7402细胞对DCA不敏感可能与其对PDK1途径依赖程度较低有关。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 潘宗延 ,丁鼎乐;基于调节细胞生长的治癌新尝试[J];世界科学;2005年06期

2 彭岳;赵铁建;谢海源;韦燕飞;;细胞培养实验中一些细节问题的探讨[J];中华中医药学刊;2009年06期

3 郑丽君;夏文美;童村;;HeLa细胞的培养与使用[J];医药工业;1983年10期

4 李少英;李月秋;朱金玲;;三种细胞生长状况的观察[J];佳木斯医学院学报;1995年06期

5 严国俊;裴燕芳;朱贞宏;吴洁颖;潘金火;;实时细胞电子分析技术的应用研究进展[J];中国药学杂志;2014年03期

6 陈必良,穆润华,马向东,王德堂,辛晓燕,郑维国,严瑞兰;特异性反义寡核苷酸对含HPV16的SiHa细胞的作用[J];第四军医大学学报;2000年03期

7 孟洪弟,戚豫,潘虹,吴希如;无线粒体DNA的ρ°206细胞的培养及其呼吸链功能损害[J];中国优生与遗传杂志;2000年03期

8 何秉燕;邓长生;邹典定;刘湘芬;易有荣;;G-CSF对洛伐他汀诱导的K562细胞内酸碱度及凋亡的影响[J];中华血液学杂志;2006年07期

9 黄静红;李德如;阎国富;;萝卜硫素对HaCaT细胞的影响研究[J];中国美容医学;2010年11期

10 章静波,叶祝三;保护正常组织和细胞——肿瘤化疗研究中的一个动向[J];国外医学参考资料(肿瘤学分册);1978年01期

相关会议论文 前10条

1 刘令九;赵小琳;岳立广;徐艳玲;李淑焱;侯丽娟;隋红;姜崴;谢宝生;李勇;刘兵;李海滨;;细胞工厂培养人胚肺二倍体细胞制备冻干甲型肝炎减毒活疫苗[A];2011中国生物制品年会暨第十一次全国生物制品学术研讨会论文集[C];2011年

2 宋征;;应用Bhas42细胞试验检测22个肿瘤促长基因标志物[A];2013年（第三届）中国药物毒理学年会暨药物非临床安全性评价研究论坛论文摘要[C];2013年

3 谷彬;张辉;喻泽兰;;依地福新对Jurkat细胞生长抑制机制的研究[A];2009医学前沿论坛暨第十一届全国肿瘤药理与化疗学术会议论文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亚;袁星;;双酚-A对MCF-7细胞伏安行为的影响[A];第五届全国环境化学大会摘要集[C];2009年

5 李晓飞;吕超;吴小荣;韩庆玲;王杰;易宗春;;铅和铝离子对K562细胞红系分化的影响[A];全国生化/工业与卫生毒理学学术会议论文集[C];2010年

6 宋为民;郭波;;复方甘草酸苷对HaCaT细胞表达AQP3的影响[A];2011全国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2011年

7 刘鲁明;钱华;陈震;林胜友;黄挺;;参麦注射液对肿瘤细胞环核甘酸的影响[A];全国中医药科研与教学改革研讨会论文集[C];2000年

8 张雪玲;糜漫天;李等松;韦娜;张乾勇;杨志祥;;Lovastatin对HL-60细胞HMG-CoA还原酶mRNA表达及细胞增殖功能的影响[A];中国营养学会特殊营养第五届学术会议论文摘要汇编[C];2002年

9 房佰俊;廖联明;杨少光;史明霞;赵春华;;胎儿骨髓源原始干细胞分离纯化及其生物学特性的初步研究[A];第九届全国实验血液学会议论文摘要汇编[C];2003年

10 李晓军;朱传东;汪萍;贾丽;陈芳芳;夏欣一;陈龙邦;;人Id3基因在A549细胞中的表达及对细胞生长功能的研究[A];第六届全国免疫学学术大会论文集[C];2008年

相关重要报纸文章 前10条

1 记者 吴春燕 通讯员 宁习源 吴剑鹏;人类情绪可影响干细胞生长[N];光明日报;2014年

2 冯卫东;老化干细胞可转变成年轻干细胞[N];科技日报;2012年

3 常丽君;科学家阐明核内周期运作机制[N];科技日报;2011年

4 本版编辑邋杜华斌 邰举 毛文波 顾钢 陈超 何屹 毛黎;2007年世界科技发展回顾(六)[N];科技日报;2008年

5 通讯员 李静;厦大教授发现细胞防癌“玄机”[N];厦门日报;2009年

6 永诚;美发现控制细胞生长的蛋白质[N];中国医药报;2000年

7 记者 张孟军;加找到刺激干细胞生长分子[N];科技日报;2001年

8 张田勘;干细胞研究精彩纷呈[N];中国医药报;2011年

9 邵薇/编译;T细胞的非凡能力[N];北京科技报;2003年

10 经天;控制细胞生长的蛋白质[N];中药事业报;2000年

相关博士学位论文 前10条

1 蒋渊;缺氧肝癌细胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子机制的研究[D];第三军医大学;2015年

2 张广;肝星状细胞在肝癌细胞恶性行为中的作用及机制研究[D];南京医科大学;2015年

3 付托;活性氧族在CHO细胞补料批次培养中的作用、机制及调控研究[D];第二军医大学;2016年

4 彭林;重组凝血因子VII在CHO细胞中的高效表达[D];江南大学;2017年

5 杨静波;土贝母甲素对雄激素非依赖性前列腺癌细胞的抑制作用及机制研究[D];吉林大学;2017年

6 李麟;USP18在IFN-α抗乙肝病毒机制中的作用及调控研究[D];重庆医科大学;2017年

7 杨小超;阳离子配体修饰的纳米金用于细胞转运和微囊自组装研究[D];重庆大学;2010年

8 叶玲玲;基于生物素诱导表达系统的HEK293细胞多基因代谢工程改造[D];中国人民解放军军事医学科学院;2011年

9 梁国斌;产朊假丝酵母生产谷胱甘肽过程控制与优化[D];江南大学;2008年

10 杨海虹;钙池操纵性钙内流在人肺腺癌A549细胞中的研究[D];南方医科大学;2012年

相关硕士学位论文 前10条

1 柯自立;硫酸镁对6-羟基多巴胺损伤的SH-SY5Y细胞的保护作用[D];福建医科大学;2015年

2 李婷婷;细胞穿透肽VP22对抑癌蛋白PTEN体外抗肿瘤作用影响的研究[D];川北医学院;2015年

3 王静;环氧化物酶抑制剂NS-398联合奥沙利铂对宫颈癌Hela细胞增殖和凋亡的影响[D];河北医科大学;2015年

4 郑禄禄;番茄红素对转染SOD1-G93A的PC12细胞线粒体的保护作用[D];河北医科大学;2015年

5 宋晨源;氯化铵对人正常肝细胞系changliver中二氢乳清酸脱氢酶表达的影响[D];郑州大学;2015年

6 张莉;白藜芦醇体外抑制肠道病毒71型的作用机制研究[D];苏州大学;2015年

7 高华武;富硒芪云抗肿瘤作用及其机制的实验研究[D];安徽中医药大学;2015年

8 宋加奎;丹参对人胃癌SGC-7901细胞化疗敏感性的影响[D];安徽中医药大学;2015年

9 许雅鑫;尼古丁对NCI-H1975和NCI-H460细胞促进增殖作用及对PI3K/Akt通路的影响研究[D];山西医科大学;2015年

10 高娜;加减驻景方含药血清对二氯化钴诱导后ARPE-19细胞表达VEGF及HIF-1α的影响[D];青海大学;2015年

，

本文编号：1472123