靶向沉默Wip1基因协同放疗对体外培养胶质瘤细胞的影响研究

发布时间：2018-01-29 14:21

  本文关键词： 野生型p53诱导的磷酸酶1 细胞周期检查点激酶1 细胞周期检查点激酶2 胶质瘤 放疗抵抗 电离辐射　出处：《南方医科大学》2016年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胶质瘤占原发性颅内恶性肿瘤的80%,具有高度的侵袭性,且易复发。随着神经外科手术技术和肿瘤学的不断进步,手术结合放化疗已经成为胶质瘤的常规治疗方案,但是其预后仍然不容乐观,对人类的生命健康造成了严重的困扰。野生型p53诱导的磷酸酶1 (Wild-type p53-induced phosphatase 1,Wipl)属于蛋白磷酸酶2C (protein phosphatase 2C, PP2C)家族,由PPM1D基因编码,单体结构,对冈田酸不敏感。Wipl基因是一个癌基因,促进肿瘤的发生、发展和侵袭,对肿瘤细胞的增殖、凋亡以及应激损伤的修复产生重要影响。研究证实,不同p53状态的胶质瘤细胞对于放疗的敏感性不同,而Wip1又由p53诱导,且Wip1在应对不同程度的应激损伤时其表达量也有差异,因此推测,Wipl可能影响胶质瘤细胞对放疗的敏感性,且Wip1基因的沉默协同放疗可能会对细胞的增殖能力产生影响。细胞周期检验点激酶1 (checkpoint kinase 1, Chkl)和细胞周期检验点激酶2(checkpoint kinase 2, Chk2)都是Wipl作用的下游靶点,对细胞的正常生存均有重要意义,可以调控细胞的细胞周期、凋亡、和增殖。有研究证实,Chkl和Chk2的表达可以影响肿瘤细胞放疗后的增殖能力,因此如果Wipl基因沉默协同放疗可以对胶质瘤细胞的增殖能力产生影响,则可能是通过调节Chkl和Chk2的表达来实现。本研究主要通过构建胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型并协同放疗阐释Wip1基因在胶质瘤细胞放疗抵抗中的作用,以及Wipl基因沉默协同放疗对细胞增殖能力影响的作用机制,为提高胶质瘤的治疗效果提供坚实的理论基础。全文分为三个部分：第一章胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型的建立及协同放疗对U-251胶质瘤细胞增殖影响的研究第二章靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chkl表达变化的研究第三章靶向Wip1沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk2表达变化的研究以均数±标准差(x±S)的形式表示计量资料。使用SPSS19.0软件对数据进行分析,采用单因素方差分析(one-way ANOVA)对两个组间的差异进行比较,多重比较采用LSD检验,以p0.05为差异有统计学意义。第一章U-251胶质瘤细胞系Wipl基因沉默模型的建立及协同放疗对胶质瘤细胞增殖影响的研究目的构建U251胶质瘤细胞系Wip1基因沉默模型,研究Wipl基因沉默协同放疗对胶质瘤细胞增殖的影响。方法培养U-251细胞,使用慢病毒感染U251细胞,构建U251细胞Wip1基因沉默模型,荧光显微镜下观察细胞感染效率。细胞的Wipl基因被有效沉默后,对细胞进行放疗干预。根据干预方式,将细胞如下分组：Wip1沉默放疗组(IR+Wipl-)、Wip1沉默组(Wipl-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。对干预后的各组细胞采用CC8法检测细胞增殖。结果1.使用慢病毒感染U-251细胞3-4d后,采用荧光倒置显微镜对细胞进行观察,根据绿色荧光蛋白表达情况来确定感染效率,以绿色荧光表达的细胞占总细胞90%以上为感染成功。结果显示感染效率均90%以上。2.Wip1基因沉默协同放疗处理后细胞增殖明显下降：U-251细胞Wip1基因被有效沉默并放疗后,对各组细胞增殖情况采用cck-8法检测,细胞增殖速率由低到高依次为Wip1沉默放疗组、Wip1沉默组、单纯放疗组、阴性对照未放疗组,随着时间的延长,以上4组差异逐渐增大,第24h (P0.05)、48h (P0.05)、72h (P0.05)、 96h (P0.05)、120h (P0.05)各个时间点组间差异均有统计学意义。放疗后第24h、48h、72h、96h、120h五个时间点,单纯放疗组和Wip1沉默组的增殖率均显著低于阴性对照未放疗组(P0.05),差异有统计学意义。第24h、72h、96h、120h四个时间点,Wip1沉默放疗组细胞增殖率低于单纯放疗组(P0.05)、Wip1沉默组(P0.05)和阴性对照未放疗组(P0.05),差异有统计学意义。放疗后第48h Wip1沉默放疗组增殖率低于单纯放疗组(P0.05)和阴性对照未放疗组(P0.05),差异有统计学意义。结论采用慢病毒载体构建成功构建U251胶质瘤细胞Wip1基因沉默模型,单纯Wip1基因沉默和单纯的放疗均可显著降低U251细胞的增殖能力,而Wip1基因沉默协同放疗处理的细胞,增殖能力又显著低于单纯放疗和单纯Wipl基因沉默处理的细胞,Wipl的基因表达影响胶质瘤的放疗抵抗。第二章靶向Wip1沉默协同放疗在U1-251胶质瘤细胞中Chk1表达变化的研究目的通过靶向Wipl基因沉默协同放疗,检测Chkl的mRNA和蛋白的表达变化,研究Wip1基因沉默协同放疗降低胶质瘤细胞增殖能力的作用机制。方法细胞的Wip1基因被有效沉默后,对细胞进行放疗干预。根据干预方式,将细胞如下分组：Wipl沉默放疗组(IR+Wipl-)、Wipl沉默组(Wipl-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。放疗后24小时提取细胞RNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测Chkl的mRNA和蛋白的表达量。结果采用荧光实时定量Q-PCR检测Chkl的mRNA表达情况。Chkl的mRNA表达以NC组作为对照组表达量为1,IR+Wipl-组、Wip1-组、IR组的Chkl mRNA的相对表达量依次为1.712±0.057、2.914±0.087、0.815±0.018,组间差异显著(P0.05),有统计学意义。Wipl-组高于NC组(p0.05),IR组低于NC组(p0.05),IR+Wip1-组相对Wip1-组表达降低(p0.05),但高于NC组和IR组(p0.05),差异有统计学意义。Western Blot检测Chkl条带分子量大小约54kDa左右,灰度分析得出,IR+Wip1-组的Chkl蛋白相对表达量为0.571±0.072,Wipl-组为0.631±0.052,IR组为1.056±0.121,NC组的Chkl蛋白相对表达量为0.,950±0.105,组间差异显著,具有统计学意义(P0.05).Chkl的蛋白表达,IR组高于NC组(P0.05),Wip1-组低于NC组(P0.05),而IR+Wip1-组的Chkl蛋白表达低于IR组和NC组(P0.05),差异有统计学意义。结论对U-251细胞靶向沉默协同放疗后,细胞的Chkl mRNA表达相对升高,而蛋白表达降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chkl的蛋白表达实现对胶质瘤增殖的抑制。第三章靶向Wipl沉默协同放疗在U-251胶质瘤细胞中Chk2表达变化的研究目的通过靶向Wip1基因沉默协同放疗,检测Chk2的mRNA和蛋白的表达变化,研究Wip1基因沉默协同放疗降低胶质瘤细胞增殖能力的作用机制。方法细胞的Wipl基因被有效沉默后,对细胞进行放疗干预。根据干预方式,将细胞如下分组：Wipl沉默放疗组(IR+Wip1-)、Wipl沉默组(Wipl-)、单纯放疗组(IR)和阴性对照未放疗组(NC)。放疗后24小时提取细胞RNA和蛋白,采用实时荧光定量PCR及Western Blot方法检测Chk1的mRNA和蛋白的表达量。结果各组U-251细胞Chk2的mRNA实时荧光定量Q-PCR检测结果采用荧光实时定量Q-PCR检测Chk2的mRNA表达情况。Chk2的mRNA表达以NC组作为对照组表达量为1,IR+Wipl-组、Wipl-组、IR组的Chk2 mRNA的相对表达量依次为0.541±0.057、0.739±0.036、0.777±0.016,组间差异显著(P0.05),差异有统计学意义。Chk2的mRNA表达,IR组、Wip1-组和IR+Wip1-组显著低于NC组(P0.05),差异有统计学意义,而IR+Wip1-组的Chk2 mRNA又分别低于IR组(P0.05)和Wipl-组(P0.05),差异有统计学意义。各组U-251细胞Chk2的Western blot蛋白表达检测结果：Western Blot检测Chk2条带分子量大小约63kDa左右,灰度分析得出,IR+Wip1-组、Wip1-组、IR组、NC组蛋白相对表达量依次为0.450±0.062、0.756±0.063、0.591±0.075、0.837±0.084,组间差异显著(P0.05),具有统计学意义。Chk2蛋白表达,IR组低于NC组(p0.05),差异有统计学意义。而IR-Wip1-组又分别低于Wip1-组(p0.05). IR(p0.05)组和NC组(p0.05),差异有统计学意义。结论对U-251细胞靶向沉默协同放疗后,细胞的Chk2 mRNA和蛋白表达均降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chk2的mRNA和蛋白表达来抑制胶质瘤细胞的增殖能力。全文结论1)通过采用慢病毒感染U-251细胞,成功构建U-251细胞Wip1基因沉默模型。2)Wip1基因沉默协同放疗干预后的U-251细胞的增殖能力显著下降,说明Wip1基因沉默协同放疗可以显著抑制胶质瘤细胞的增殖,Wipl基因是导致细胞放疗抵抗的重要因素。3)Wip1基因沉默协同放疗后,Wip1的下游作用靶点Chkl的mRNA表达显著升高,而蛋白表达降低；Wip1基因沉默协同放疗可通过影响Chk1的蛋白表达实现对胶质瘤增殖的抑制。4)Wipl基因沉默协同放疗后,Wipl的下游作用靶点Chk2的mRNA和蛋白表达均降低。Wip1基因沉默协同放疗可通过降低Chk2的mRNA和蛋白表达来抑制胶质瘤细胞的增殖能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

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