CRH调节结肠癌发生发展的分子机制研究

发布时间：2018-01-29 23:39

本文关键词： 肠炎相关性肠癌 CRHR1 肿瘤发生 NF-κB STAT3 CRH CRHR1 结肠癌细胞增殖 IL-6 JAK2/STAT3 CRH CRHR1 NF-κB VEGF 血管生成　出处：《南京医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：结肠癌是我国常见的恶性肿瘤,具有高发病率和高致死率的特性。肠道炎性疾病是结肠癌发病的高危因素,例如患有溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)的病人结直肠癌的发病率显著高于普通人群。CRHⅠ型受体(corticotropin-releasing hormone receptor 1,CRHR1)及其配体促肾上腺皮质激素释放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)和优洛可定(Urocortin,Ucn1)已被证实对肠道炎症具有明确的调节作用,但是它们对结肠癌发生发展的影响尚不明了。CRH是由41个氨基酸组成的多肽,它是CRH家族肽中的一员,其他的CRH家族肽包括Ucn1、Ucn2和Ucn3。该家族肽主要是通过两种G蛋白耦联受体(CRHR1和CRHR2)发挥生物学功能,其中CRH主要与CRHR1结合发挥作用,它与CRHR1的结合亲和力大约是与CRHR2的20倍,Ucn1与CRHR1和CRHR2均有较高亲和力,而Ucn2和Ucn3则只与CRHR2结合。CRH家族成员最早被发现作用于中枢神经系统中,调节机体对外界压力的反应。后期发现它们也广泛分布于外周组织中并对许多疾病的炎症反应具有调节作用。近期研究发现CRH家族肽及其受体对肿瘤疾病也有调节作用,但所报道作用比较复杂。已有研究报道在溃疡性结肠炎患者结肠中发现了 CRH及CRHR1的表达,并且它们在肠道免疫系统中发挥促炎作用。此外在葡聚糖硫酸钠(dextran sodium sulfate,DSS)诱导的结肠炎小鼠模型中,研究发现CRHR1的敲除能明显改善结肠炎症状况。以上研究表明CRH及其受体CRHR1在肠道炎症中发挥着明显的促炎作用。此外大量的研究证实CRH家族肽及其受体在心血管系统中也发挥着调节作用,能够调节血管通透性、血管生成和血管炎症。鉴于慢性炎症、血管生成与肿瘤的发生发展有着密切的联系,CRH及其受体在肠道系统中的促炎效应以及对血管的调节作用提示我们其潜在的促癌作用。因此,本文研究利用小鼠肠炎相关性肠癌(colitis-associated cancer,CAC)模型及结肠癌细胞系探索CRH及其受体CRHR1在结肠癌发生发展中的作用及其可能机制。第一部分CRHR1对小鼠肠炎相关性肠癌发生发展的调节作用目的:明确CRHR1对小鼠CAC发生发展的调节作用。方法:利用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)和DSS两种药物诱导建立小鼠CAC模型。通过免疫组织化学(immunohistochemistry,IHC)、实时荧光定量PCR(quantitative RealtimePCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Westernblot)技术检测CAC小鼠肠道中CRHR1及其配体Ucn1和CRH的表达。选用CRHR1-/-和CRHR1+/+两组小鼠建立CAC模型并进行观察对比。造模期间记录两组小鼠的存活率及体重变化。造模结束后观察分析两组小鼠结肠部位的长度、肿瘤数目和大小及肿瘤发生率。另外对结肠组织进行组织学分析,对炎症、溃疡、增生、及损伤面积这四个方面进行组织学评分。利用qRT-PCR技术检测两组小鼠结肠组织中炎性细胞因子的表达。最后利用末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记测定法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)和 5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BRDU)染色检测两组小鼠结肠部位细胞的凋亡和增殖水平,通过Western blot技术检测凋亡相关蛋白的表达以及与肿瘤细胞增殖和凋亡密切相关的两种转录因子核转录因子κappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)和信号转导与转录活化因子(signal transducers and activators of transcription,STAT3)的表达和磷酸化水平。结果:造模第80天分离结肠,可见腺癌发生,CAC造模成功。IHC、qRT-PCR及Western blot结果显示CAC小鼠结肠组织中CRHR1及其配体CRH和Ucn1在mRNA和蛋白水平的表达均显著高于正常组小鼠。此外对比CRHR1+/+和CRHR1-/-两组造模小鼠,我们发现在整个造模期间CRHR1+/+小鼠存活率较低,且体重下降更为明显。造模80天结束后,CRHR1+/+小鼠结肠部位肿瘤数目、大小及肿瘤发生率均显著高于CRHR1-/-造模组。IHC结果显示CRHR1+/+造模组中约有70%呈现高级别异型增生,且其中30%的小鼠可见腺癌发生,而仅40%的CRHR1-/-造模小鼠观察到高级别异型增生且没有腺癌发生。组织学评分结果显示CRHR1+/+小鼠在炎症、溃疡、增生及损伤面积四个方面的评分都显著高于CRHR1-/-小鼠。qRT-PCR结果显示,对比CRHR1-/-造模小鼠,CRHR1+/+造模小鼠结肠组织中促炎因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和肿瘤坏死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)的表达显著上升而抑炎因子白介素10(interleukin-10,IL-10)的表达显著下降。此外TUNEL染色分析发现CRHR1+/+小鼠结肠组织中细胞凋亡活动显著低于CRHR1-/-小鼠,而BRDU染色结果显示CRHR1+/+小鼠结肠组织中细胞增殖活动显著高于CRHR1-/-小鼠。同时Western blot结果显示在CRHR1+/+小鼠结肠组织中促凋亡蛋白Bcl-2表达更低而抗凋亡蛋白Bax表达更高,此外还发现NF-κB和STAT3的磷酸化水平也显著高于CRHR1-/-小鼠。结论:CRHR1的存在对小鼠CAC的发生发展有明显的促炎和促癌作用。进一步的研究显示CRHR1能够增加促炎因子IL-1 β、TNF-α和IL-6的表达与分泌,此外CRHR1激活NF-κ B和STAT3信号通路并促进结肠组织细胞的增殖、抑制细胞的凋亡,最终促进了 CAC的发生发展过程。第二部分CRH对结肠癌细胞促增殖的影响及作用机制目的:明确CRH对结肠癌细胞增殖的影响。方法:利用IHC、qRT-PCR和Western blot技术检测结肠癌病人结肠组织以及结肠癌细胞系和结肠上皮细胞系中CRH、Ucn1和CRHR1的表达。以两种结肠癌细胞系细胞DLD1和HCT116作为离体研究对象,给予CRH或CRH合并CRHR1阻断剂Antalarmin处理,研究CRH/CRHR1信号对结肠癌细胞的影响。运用细胞增殖实验和克隆形成实验观察CRH对结肠癌细胞增殖的影响。并通过流式细胞术(flow cytometry,FCM)技术进一步检测CRH对细胞周期和凋亡的影响。利用qRT-PCR和Western blot技术检测CRH处理对结肠癌细胞中IL-6表达的影响。利用Western blott技术分析具体的信号机制,检测了 CRH对NF-1κB、STAT3、JAK1/2/3和SRC等蛋白的磷酸化水平的影响。对可能的关键信号蛋白给以相应的抑制剂或siRNA干扰进行研究。结果:IHC结果显示结直肠癌病人结肠组织中CRHR1及其配体CRH和Ucn1均高表达于腺癌组织中。qRT-PCR和Western blot结果显示结肠癌细胞DLD1和HCT116中CRH和CRHR1的表达显著高于结肠上皮细胞FHC。细胞增殖实验和克隆形成实验显示CRH通过激活CRHR1能显著促进结肠癌细胞的增殖活性。FMC结果表明CRH能够显著提高G1/S期中的细胞比例从而促进细胞增殖活动,但未见CRH对结肠癌细胞有明显的细胞凋亡影响。进一步研究发现CRH能明显诱导结肠癌细胞中IL-6的表达。此外CRH能够促进NF-κB、JAK2和STAT3磷酸化水平。以上CRH的作用均能被CRHR1特异型阻断剂Antalarmin所逆转。另外IL-6的中和抗体及小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)转染能够明显抑制CRH诱导的STAT3和JAK2的磷酸化,说明IL-6介导CRH对JAK2/STAT3信号通路的激活。STAT3的抑制剂Stattic能显著抑制CRH对结肠癌细胞的促增殖作用,说明CRH对结肠癌细胞增殖活动的调节依赖于STAT3。NF-κB抑制剂CAPE明显下调CRH介导的IL-6表达,说明CRH通过NF-1κB促进IL-6的表达。结论:结肠癌细胞中CRH通过CRHR1促进IL-6表达激活JAK2/STAT3信号通路从而影响细胞周期最终促进细胞的增殖。第三部分CRH对血管内皮细胞血管生成的影响及作用机制目的:明确CRH对肿瘤血管生成的影响。方法:通过人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein vascular endothelial cells,HUVEC)在基质胶上的小管形成实验体外模拟血管生成。利用qRT-PCR和酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测 CRH对结肠癌细胞系细胞DLD1和HCT116中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表达的影响。通过 NF-κB 抑制剂 CAPE 明确NF-1κB是否参与CRH对VEGF的调节。小管形成实验检测CRH处理后的DLD1细胞条件培养基对HUVEC细胞小管形成能力的影响。通过VEGF siRNA干扰VEGF的表达进一步研究对VEGF对HUVEC细胞小管形成的影响。结果:qRT-PCR和ELISA结果显示CRH显著促进DLD1细胞中VEGF的表达。且这种促进作用被Antalarmin和CAPE抑制。小管形成实验显示CRH处理后的DLD1细胞上清明显促进HUVEC细胞的小管形成,且siRNA干扰VEGF的表达对CRH促HUVEC小管生成作用有明显的抑制作用。结论:CRH通过CRHR1激活结肠癌细胞中NF-κB促进VEGF的表达从而促进血管生成。
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【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.35

【参考文献】