WTAP基因在前列腺癌发生发展中的作用及机制研究

发布时间：2018-01-31 06:18

本文关键词： 前列腺癌 WTAP 癌基因　出处：《南京医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：前列腺癌是泌尿生殖系统常见的恶性肿瘤之一。在美国,其发病率已超过肺癌,成为危害男性健康的首位因素。在我国,由于前列腺活检技术的提高,PSA筛查的普及以及生活方式的改变,前列腺癌的发病率呈迅猛上升趋势。综合治疗通常能为早期前列腺癌患者带来相对良好的预后,然而依然存在相当一部分前列腺癌患者在发生远处转移后才得以确诊,导致预后不佳。中晚期前列腺癌患者虽然可通过接受内分泌治疗控制和改善病情,但其中绝大多数仍会进展为预后极差的去势抵抗性前列腺癌。因此,深入探寻前列腺癌发生发展的分子通路及相关基因异常,阐明肿瘤发生发展机制,寻找其转移及耐药的分子机制及有效靶点,对于提高前列腺癌的早期诊断效率、发掘新的治疗靶点与预后判断方法具有重要意义。基因在肿瘤中的表达与功能向来是肿瘤发生发展与转移机制研究的重点,也是肿瘤早期诊断,靶向治疗与预后判断研究的重点。近年来研究发现,WTAP基因在人的正常生理过程和肿瘤发生发展中均起到重要调控作用。WTAP在体内外均可与WT1基因特异性结合,可参与m6A甲基化修饰,RNA选择性剪接,细胞周期调控等多种机体正常生理过程；亦在多种恶性肿瘤如胶质母细胞瘤、胆管癌、急性髓细胞性白血病和结直肠癌的发生发展中起到重要调控作用,但WTAP在前列腺癌中的表达和作用尚不明确。本课题旨在探究前列腺癌中WTAP的表达和作用,探究前列腺癌发生及进展的分子机制,为前列腺癌的早期诊断和治疗提供新思路。第一部分WTAP在前列腺癌中的表达及临床意义目的：探讨WTAP基因在前列腺癌组织中的表达水平与相关临床病理学指标及患者预后的关系。方法：应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法和Western Blot法检测前列腺癌组织和配对的正常组织中WTAP基因的表达水平。免疫组织化学方法检测前列腺癌组织中WTAP表达情况。统计分析WTAP表达与临床指标及预后的关系。结果：qReal-time PCR检测和Western Blot检测结果显示WTAP基因在前列腺癌组织中的表达水平高于配对的正常前列腺组织(P0.05)。Kaplan-Meier分析表明,相比于WTAP低表达的患者,WTAP高表达的PCa患者的无生化复发生存时间更短(log- rank test, P 0.05)。PCa患者中WTAP表达水平与肿瘤远处转移和无生化复发生存率呈明显相关性(P0.05)。多变量分析表明,WTAP表达和肿瘤病理分级是PCa患者无生化复发生存率的独立预后因子。结论：WTAP在前列腺癌组织中高表达,WTAP高水平表达与前列腺癌远处转移和无生化复发相关,并且是PCa患者独立危险因子。第二部分WTAP对前列腺癌细胞功能的影响及分子机制的研究目的：探讨前列腺癌细胞系WTAP表达水平对细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期、动物成瘤能力的影响及可能的分子机制。方法：运用慢病毒转染法,在前列腺癌细胞系PC3、DU145、LNCaP中构建WTAP的过表达和敲低模型,并用实时荧光定量PCR(q RT-PCR)和Western blot检测转染效率。用CCK-8试剂盒检测敲低或者过表达WTAP后细胞增殖能力,并用细胞克隆实验进行验证。以Transwell法检测细胞迁移和侵袭能力。PI染色流式细胞仪检测敲低或者过表达WTAP后对细胞周期的影响。在小鼠皮下原位注射敲低或者过表达WTAP的PC3细胞或对照细胞,观察细胞在动物体内成瘤能力。结果：成功构建两株敲低shWTAP1、shWTAP2、一株过表达WTAP和阴性对照NC的稳转细胞株。稳转细胞用CCK-8染色检测细胞增殖能力,结果表明与对照NC组比,过表达WTAP细胞增殖能力明显增强(P0.05),敲低shWTAP1、 shWTAP2细胞增殖能力降低(P0.05)。细胞克隆实验进一步验证此结果。迁移和侵袭实验结果表明与对照NC组比较,过表达WTAP后PCa细胞迁移和侵袭能力明显增强(p0.01),敲低WTAP后PCa细胞迁移侵袭能力明显减弱(p0.05)。流式细胞仪检测细胞周期结果显示与对照NC组相比较,敲低前列腺癌PC3的WTAP表达,细胞周期G0/G1期比例显著增高,对应S期和G2/M期的比例明显下降(P0.05),而过表达WTAP细胞周期G0/G1期比例下降,对应S期和G2/M期比例的增加(P0.05)。裸鼠皮下成瘤试验结果显示,接种肿瘤细胞28天后与对照组相比,敲低WTAP组肿瘤的重量分别为240±29mg,120±10mg,70±12mg(以均数±标准差表示,P0.05)。通过Western blot检测WTAP表达改变前后对相关通路蛋白表达水平影响。结果表明：与对照组相比vimentin和β-actin在经过慢病毒稳转沉默后的PC3,DU145和LNCaP中明显低表达(P0.05),E-cadherin高表达(P0.05),在过表达细胞中vimentin和β-catenin高表达(P0.05)而E-cadherin低表达(P0.05)。另外,过表达WTAP的PC3,DU145与LNCaP细胞中WT1与TBL1表达升高(P0.05)；在敲低WTAP的PC3,DU145和LNCaP细胞中表达显著降低(P0.05)。结论：体外实验显示WTAP能够影响PCa细胞系增殖、迁移、侵袭和细胞周期,且进一步影响动物体内成瘤能力。并可能通过调控EMT和WTAP-WT1-TBL1通路来调节肿瘤的生物学行为。
[Abstract]:In recent years , the expression and function of WTAP gene in prostate cancer have been studied by using real - time fluorescence quantitative polymerase chain reaction ( qRT - PCR ) and Western Blot . The effects of WTAP on cell proliferation , migration , invasion , cell cycle , cell cycle , and cell cycle of PCa were investigated . The results showed that the expression of WTAP in prostate cancer cell line was significantly higher than that in control NC group ( P0.05 ) . Compared with control group , vimentin and 尾 - actin were significantly lower ( P0.05 ) . The expression of WT1 and TBL1 increased significantly ( P0.05 ) .

【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.25

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