CagA-TET1-KLF4通路在胃上皮细胞恶性转化和胃癌细胞恶性行为学中的作用

发布时间：2018-02-02 02:46

  本文关键词： 胃癌 幽门螺旋杆菌 CagA KLF4 TET1　出处：《安徽医科大学》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胃癌是起源于胃粘膜上皮的恶性肿瘤,最常见的恶性肿瘤之一,即使有先进的肿瘤切除术和分子靶向疗法,但是胃癌的预后很差,其病死率在肿瘤相关疾病中排列第二。胃癌的发病率在地理上是不同的,亚洲东部、中部、东部欧洲、中美洲和南美洲是高发地区。胃癌发生的原因至今并未明确,幽门螺旋杆菌感染、高盐饮食、抽烟等已经被证实与胃癌的发生密切相关,其中幽门螺旋杆菌感染的作用最为显著。幽门螺旋杆菌感染与多种胃肠疾病有关,包括无症状性胃炎、胃溃疡和胃癌。全球约有一半的人均有幽门螺旋杆菌感染,但是只有约1~3%的人会发展为胃癌,这也使得幽门螺旋杆菌感染成为胃癌最常见的病因。Cag A是幽门螺旋杆菌最重要的毒力致病因子,其在幽门螺旋杆菌感染引发胃癌的病理过程中起到重要的作用。Cag A在幽门螺旋杆菌体内通过其T4SS系统直接进入胃粘膜细胞,进入细胞后结合并且异常调节一系列细胞内的信号通路分子,引起细胞形态改变,如细胞分散、细胞延长、细胞伸展。另一方面,Cag A可以引起细胞内的肿瘤抑癌基因表达降低或者丢失,如P53,RUNX3,GKN1等,进而加速胃癌的发生和进程。那么,Cag A会不会对其它肿瘤抑癌基因的表达也有抑制作用呢?KLF4是一个含有锌指结构的转录因子,主要在终末分化的上皮细胞中高表达,如皮肤、肺、胃肠道等。KLF4能够抑制细胞增殖,促进细胞分化,并且与肿瘤的发生发展密切相关。在胃癌中KLF4发挥着抑癌基因的作用,和正常的胃粘膜细胞相比胃癌组织中其蛋白表达是明显降低的。所以,我们猜想Cag A会不会参与KLF4在胃癌中低表达的分子过程?在我们前期的研究中已经证实KLF4的启动子发生了甲基化是导致其表达降低的一个重要原因。而且大量的流行病学和临床数据证实,幽门螺旋杆菌感染可以增加细胞基因组的甲基化水平,从而参与胃癌的发生以及发展。为此,我们推测:幽门螺旋杆菌感染/Cag A可能通过甲基化途径引起KLF4启动子的甲基化,进而导致其在胃癌中的低表达,最终促进了胃癌的发生发展呢?为验证假说,我们首先检测正常胃上皮细胞和胃癌细胞株中KLF4的基础表达情况,然后将低表达KLF4的胃癌细胞株转染外源性Cag A表达质粒,检测KLF4的表达变化,再检测细胞行为学行为的变化情况,并进一步探索Cag A与KLF4之间的具体分子机制关系。研究方法1.WB检测一株正常胃上皮细胞和三株胃癌细胞的KLF4的基础表达水平;将高表达KLF4蛋白的GES-1胃上皮细胞和一株AGS胃癌细胞转染Cag A质粒后,用WB和RT-PCR方法检测KLF4的表达情况及其行为学变化:(1)MTT实验检测细胞增殖能力;(2)平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力;(3)Transwell实验检测细胞迁移能力。2.用CRISPR/Cas9方法建立敲低KLF4的稳定细胞株GES-1,检测其行为学变化。3.WB检测一株正常胃上皮细胞和三株胃癌细胞的TET1的基础表达水平;将高表达KLF4的GES-1胃上皮细胞转染Cag A质粒后,WB和RT-PCR方法检测TET1的表达情况;用CRISPR/Cas9方法建立敲低TET1的稳定细胞系GES-1,WB方法检测KLF4的表达情况。4.将低表达KLF4的胃癌细胞株转染TET1质粒过表达后,RT-PCR方法检测KLF4的表达情况以及行为学变化:Transwell实验检测其迁移能力。5.收集88例临床胃癌病人资料和病理标本,临床数据分析幽门螺旋杆菌与胃癌相关指标的相关性;免疫组化检测在胃癌组织中幽门螺旋杆菌感染与KLF4和5hmc的相关性。研究结果1.KLF4在胃癌细胞中是低表达的;2.在正常胃上皮GES-1细胞和AGS细胞中转染Cag A质粒后KLF4的表达下降,且细胞的增殖能力明显上升,平板克隆形成能力也明显上升,细胞迁移能力明显增强;3.稳定敲低KLF4的GES-1细胞与未处理GES-1细胞相比,其增殖能力,克隆形成能力和迁移能力也明显增强;4.TET1在胃癌细胞中是低表达的,正常胃上皮细胞转染Cag A后TET1表达降低;稳定敲低TET1的GES-1细胞中发现KLF4的蛋白表达也明显降低;在胃癌细胞中过表达TET1后KLF4的表达升高,且细胞的迁移能力也明显降低;5.临床数据分析结果显示,幽门螺旋杆菌感染与胃癌的组织分化和淋巴结转移有相关性;免疫组化结果显示,KLF4和5hmc在癌旁组织、无幽门螺旋杆菌感染的胃癌组织、有幽门螺旋杆菌感染的胃癌组织中表达依次降低,这也表明幽门螺旋杆菌感染与胃癌组织中的KLF4和5hmc表达呈负相关。结论1.Cag A的质粒转染降低了KLF4的表达,促进了胃上皮GES-1细胞的恶性转化和胃癌细胞的恶性行为学改变。2.Cag A的质粒转染降低了TET1的表达,而TET1表达的降低可能与增加KLF4启动子甲基化水平有关。3.KLF4和5hmc在幽门螺旋杆菌感染的胃癌细胞中表达低于幽门螺旋杆菌未感染的胃癌组织中。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

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本文编号：1483448