BMP-2对骨巨细胞瘤基质细胞抑制作用的实验研究

发布时间：2018-02-02 13:27

本文关键词： 骨巨细胞瘤人类重组骨形态发生蛋白凋亡细胞周期辅助治疗动物模型　出处：《南方医科大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：[背景]:骨巨细胞瘤是一种常见的具有侵袭性的原发性骨肿瘤,发病年龄多在20-40岁,女性较男性更为常见,骨巨细胞瘤治疗的最大的困难是骨巨细胞瘤的复发,目前研究证实,骨巨细胞瘤对传统的放疗及化疗不敏感,手术治疗仍然是骨巨细胞瘤最主要的治疗方式,目前常采用化学试剂或物理方法作为辅助治疗进行病灶的囊壁处理,消灭残留的骨巨细胞瘤细胞,降低骨巨细胞瘤的复发率;但这些方法存在全身毒性和难以控制杀伤范围的缺点,对于骨盆、脊柱及严重侵犯软组织的四肢骨巨细胞瘤,难以做到扩大切除和瘤腔处理,无法有效地降低复发率。骨巨细胞瘤主要成分包括破骨细胞样多核巨细胞、成纤维细胞样单核基质细胞及巨噬细胞样单核细胞。基质细胞负责肿瘤细胞的增殖,是引起术后复发的主要细胞;因此,表达肿瘤特性的基质细胞是肿瘤辅助治疗的重要目标。本课题组之前的体外实验研究中,发现新一代双膦酸盐不仅可抑制破骨细胞介导的骨吸收,延缓破骨细胞生成和成熟并诱导破骨细胞凋亡,而且能够直接作用于肿瘤细胞而发挥抑制肿瘤的作用。在国家自然科学基金的支持下,我们通过检索大量文献,探索BMP-2是否也具有相似的作用。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是多功能生长因子,属于转化生长因子TGFβ超家族,是一组具有类似结构的高度保守的功能蛋白,已经发现的BMPs有15种,根据它们氨基酸序列的类似分为3个群:BMP-2,BMP-4、BMP-5、BMP-8、BMP-3 及 GDF-101。其中 BMP-2 是目前研究最为广泛、诱导成骨活性最强的BMP之一,BMP-2最初是作为能够在体内诱导骨和软骨的形成的因子为人们所认识的,对骨骼的胚胎发育和再生修复起重要作用。重组人类骨形态发生蛋白2(rhBMP-2)于2002年被美国国家食物与药品管理局(FDA)批准上市,已经成为最常用的骨移植替代物,首例国产rhBMP-2用于治疗骨缺损于2014年7月6日在成都军区昆明总医院取得成功,标志着全国多中心的临床试验已经开始。除此之外研究认为,BMP-2参与调节许多种肿瘤细胞的增殖、趋药性、抗血管性、分化和凋亡的生物学过程。rhBMP-2能降低乳腺癌细胞的增殖,它既能抑制高转移细胞系也能抑制低转移细胞系细胞的增殖,但是其抑制高转移细胞的活性比低转移细胞强得,BMP-2对6种结肠癌细胞系:H T29、CAC0-2、DLD-1、SW480、HCT116和LS174-T细胞的生物学行为的影响,均具有明显的抑制生长作用7-8;但是BMP-2通过MAPK信号途径的激活,刺激ASPC-1及CAPAN-1胰腺癌细胞系的生长,及通过SMAD-1/5信号通路的激活,刺激NSCLC肺癌细胞系的生长9-10。所以BMP-2是一把双刃剑,对不同的肿瘤产生不同的作用,但是迄今关于BMP-2对骨巨细胞瘤的体外研究研究很少,也没有关于体内动物肿瘤模型的研究,假设BMP-2能抑制骨巨细胞瘤的生长,即在骨巨细胞瘤患者的辅助治疗中,即可以抑制残留的肿瘤细胞的生长,又可以刺激周围的正常成骨细胞,而诱导成骨,从而降低骨巨细胞瘤的复发率。[目的]1)探讨rhBMP-2在体外抑制骨巨细胞瘤基质细胞生长的最佳浓度;2)探讨rhBMP-2对骨巨细胞瘤基质细胞的细胞周期及凋亡的影响;3)初步探讨rhBMP-2是通过何种肿瘤细胞凋亡通路起作用;4)建立骨巨细胞瘤裸鼠皮下种植肿瘤,探讨rhBMP-2对骨巨细胞瘤裸鼠皮下种植肿瘤的抑制作用;[方法]1、体外培养骨巨细胞瘤细胞系。实验标本来自2013年02月至2013年12月广州军区广州总医院及南方医科大学附属南方医院收治的9例四肢骨巨细胞瘤患者。其中男性3例,女性6例,年龄16-35岁。肿瘤影像学分级按Campanacci分级标准,其中Ⅱ级5例,Ⅲ级4例。所有患者术前均未接受任何辅助治疗,术后均经过病理诊断为骨巨细胞瘤。对术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织在DMEM培养基中进行原代培养,待骨巨细胞瘤细胞经9次传代纯化后收集细胞冻存于液氮中备用。2、使用四甲基偶氮唑盐比色法(MTT法)法检测不同浓度的rhBMP2(0,10,100,300 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞的生长抑制情况,得出最佳抑制浓度。常规复苏原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞,在DMEM培养基培养24小时后,消化肿瘤细胞,接种到96孔板里面,分4组,分别是rhBMP2(0,10,100,300 ng/ml)组,每组3个复孔,在DMEM培养基中连续培养,使用MTT法检测出第1、3、5、7天的各组吸光光度值,应用SPSS 19.0统计学软件将各组吸光光度值进行析因分析,不同浓度及不同时间点的结果采用单因素方差分析(one-way ANOVA)分析,组间多重比较采用LSD test。根据MTT法实验结果,得出rhBMP2(10 ng/ml)在第5、7天均显著抑制骨巨细胞瘤基质细胞的生长,所以后续的流式细胞仪检测肿瘤细胞周期及凋亡的变化,及使用Western法检测肿瘤细胞的信号通路均使用添加rhBMP2(10 ng/ml)的DMEM肿瘤细胞培养组为实验组,对照组为未添加rhBMP2的DMEM肿瘤细胞培养组。3、流式细胞定量分析法检测实验组rhBMP2(10 ng/ml)及空白对照组rhBMP2(0 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞作用48小时后细胞周期变化情况。将原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞消化,接种到24孔培养板里面,分两组:实验组添加rhBMP2(10 ng/ml)DMEM培养液,空白对照组未添加rhBMP2的DMEM培养液,在DMEM培养基连续培养48小时候,使用流式细胞仪PI染色检测两组细胞周期的变化,实验组与对照组的G0/G1,S与G2/M比较应用SPSS 19.0统计学软件进行独立样本t检验。4、Annexin-V FIT流式细胞仪检测实验组rhBMP2(10 ng/ml)及空白对照组rhBMP2(0ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞作用48、72小时后细胞凋亡变化情况。将原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞消化,接种到24孔培养板里面,分两组:实验组添加rhBMP2(10 ng/ml)DMEM培养液,空白对照组未添加rhBMP2的DMEM培养液,在DMEM培养基连续培养48、72小时候后,使用流式细胞仪Annexin V-PE与7-AAD双染色检测两组细胞凋亡的变化,实验组与对照组的凋亡比较应用SPSS 19.0统计学软件进行独立样本t检验。5、Western blot 检测实验组 rhBMP2(10 ng/ml)及空白对照组 rhBMP2(0 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞作用72小时后非Smad途径丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的Erk1/2、p38、JNK的表达情况。将原代培养的骨巨细胞瘤基质细胞消化,接种到6孔培养板里面,分两组:实验组添加rhBMP2(10 ng/ml)DMEM培养液,空白对照组未添加rhBMP2的DMEM培养液,在DMEM培养基连续培养72小时候后,消化细胞并采用Western印迹杂交检测肿瘤细胞的p-Erk1/2、Erk1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK的灰度值,实验组与对照组的灰度值比较应用SPSS 19.0统计学软件进行独立样本t检验。6、体内动物实验,初步检测实验组rhBMP2(10ng/ml)及空白对照组rhBMP2(0 ng/ml)处理后的骨巨细胞瘤基质细胞,在裸鼠皮下种植肿瘤的生长情况。实验组rhBMP2(10 ng/ml)及空白对照组rhBMP2(0 ng/ml)处理骨巨细胞瘤基质细胞72小时后,消化细胞,10%PBS调整细胞浓度为1×106/ml,种植于SPF环境下饲养的BALB/C雌性裸鼠(6～8周龄,体重22～24g)背部皮下,每只裸鼠种植背部4个部位,共种植12只(实验组与对照组各6只),连续观察12周,直到12周后仍任未成瘤,最后把这些裸鼠全部处死。同理复苏鼠骨肉瘤细胞UMR106细胞系并在DMEM培养基中培养72小时后,消化细胞,使用1×106/ml浓度肿瘤细胞注射到10只裸鼠背部四个部位,1周后9只均成瘤,但是7只裸鼠背部3个部位成瘤,连续观察1周后随机处死4只成瘤的裸鼠,第2周处死剩余的落实,并取出肿瘤标本进行HE染色及PCNA免疫组化染色,来观察肿瘤的增殖情况。因为骨肉瘤细胞种植模型与本课题不相关,所以体内动物实验宣告结束。[结果]1、术中切除的骨巨细胞瘤新鲜组织在DMEM培养基中进行原代培养9次后,在显微镜下见到肿瘤细胞为均一、纯化的骨巨细胞瘤基质细胞,消化肿瘤细胞,冻存于液氮中,用于本次实验。2、MTT法检测不同浓度的rhBMP2(0,10,100,300 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞分别作用1、3、5、7天的生长抑制情况。第1、3天各组之间没有显著性差异(P0.05),其中第1天rhBMP2(100,300 ng/ml)组与对照组相比产生了轻度的刺激生长,但无显著性差异(P0.05);第5天rhBMP2(10,100 ng/ml)组与对照组相比明显抑制肿瘤细胞的生长(P0.001),rhBMP2(300 ng/ml)组与对照组相比明显抑制肿瘤细胞的生长(P0.05);第7天rhBMP2(10,100,300ng/ml)组与对照组相比明显抑制肿瘤细胞的生长(P0.001)。3、流式细胞仪流式细胞仪检测rhBMP2(0、10 ng/ml)对肿瘤细胞作用48小时后细胞周期变化情况,骨巨细胞瘤基质细胞的G0/G1,S与G2/M期两组均无显著性差异(P0.05)。4、流式细胞仪检测rhBMP2(0、10 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞作用48、72小时后细胞凋亡变化情况。肿瘤细胞被rhBMP-2(10ng/mL)处理48小时后,实验组与空白对照组的凋亡细胞数量无明显差异,但是实验组坏死细胞数量明显多于空白对照组(P0.05);肿瘤细胞被rhBMP-2(10 ng/mL)处理72小时后,实验组坏死细胞与凋亡细胞数量明显多于空白对照组(P0.01);5、Western blot检测实验组rhBMP2(0、10 ng/ml)对骨巨细胞瘤基质细胞作用72小时后非Smad途径丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路中的p-Erk1/2、Erk1/2、p-p38、p38、p-JNK、JNK 的表达情况。rhBMP2(10 ng/ml)组与空白对照组处理骨巨细胞瘤基质细胞72小时后Erk1/2、p38、JNK的表达均无显著性差异(P0.05);rhBMP2(10 ng/ml)组与处理骨巨细胞瘤基质细胞72小时后p-Erk1/2、p-p38、p-JNK的表达均明显高于空白对照组(P0.05);6、体内动物实验,因为连续观察骨巨细胞瘤裸鼠皮下种植模型12周后仍未成瘤,宣告体内动物实验结束。[结论]rhBMP-2具有抑制骨巨细胞瘤基质细胞生长及诱导凋亡作用。其作用方式可能与药物浓度相关性不高。在体外实验中,10 ng/ml浓度rhBMP2处理骨巨细胞瘤基质细胞72小时后,明显诱导肿瘤细胞凋亡。因此,维持低剂量rhBMP2辅助治疗骨巨细胞瘤能够诱导残留肿瘤基质细胞凋亡,可以避免骨巨细胞瘤手术中过多正常骨骼的切除,并可以促进病灶周围骨组织的强化或重建,减少术后骨折等并发症,并可以减少高浓度辅助用药的全身不良反应。使用rhBMP2(10ng/ml)处理48小时后,骨巨细胞瘤基质细胞的细胞周期(G0/G1,S与G2/M期)无明显差异(P0.05),表示rhBMP2未像早期影响其他肿瘤细胞生长一样通过G1停滞2-3。MAPK相关蛋白ERK(1/2),p38与JNK信号通路在成骨细胞分化、生长增殖、凋亡等多种生理过程发挥重要作用。使用rhBMP2(10ng/ml)处理72小时后MAPK相关蛋白pERK(1/2),pp38与pJNK的表达均显著增加(P0.05)。说明rhBMP2通过MAPK信号通路中的ERK(1/2),p38与JNK蛋白的激活诱导细胞凋亡。通过对骨巨细胞瘤基质细胞凋亡机制的深入研究,为骨巨细胞瘤新型辅助化疗用药的选择及使用提供新途径。本研究体外实验证实低浓度rhBMP2(10ng/ml)诱导骨巨细胞瘤基质细胞凋亡,鉴于rhBMP2已经在临床上用于骨缺损、骨不连的辅助治疗,所以体外局部使用rhBMP2不但可以减少残余肿瘤细胞,起到"安全地囊壁处理"的作用,对于不能广泛切除(如3级骨巨细胞瘤保肢手术的患者)的病例避免了过多的切除,具有预防软组织内骨巨细胞瘤的复发,进一步优化手术方案,而且可能促进病灶内骨结构的强固或重建,减少骨折等并发症的发生率的双重作用。任何抗肿瘤药物的临床应用,需要经过体外细胞、体内动物实验及Ⅰ-Ⅲ期临床试验这样的阶段才可以进入临床。根据在硕士课题期间积累的裸鼠原位种植前列腺癌动物模型操作技术,未能成功建立体内骨巨细胞瘤裸鼠皮下种植模型,同理经过培养的骨肉瘤细胞,成功建立体内骨巨细胞瘤裸鼠皮下种植模型。所以推论为使用骨巨细胞瘤系不能成功建立裸鼠皮下种植肿瘤模型,具体未成瘤机制的原因,也许与骨巨细胞瘤的恶性程度低,迄今没有专一的骨巨细胞瘤细胞系等等有关,需要后续进一步研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R738.1

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