LNK基因调控STAT3影响急性髓系白血病细胞的增殖及青蒿琥酯抗急性髓系白血病作用的研究

发布时间：2018-02-06 01:57

  本文关键词： 急性髓系白血病 淋巴细胞特异连接蛋白 信号转导与转录活化蛋白3 THP-1细胞 基因沉默 急性髓系白血病 青蒿琥酯 THP-1细胞 信号转导与转录活化蛋白3　出处：《遵义医学院》2017年硕士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一类非常常见的造血干细胞恶性克隆性疾病,其发病机制十分复杂,具有高度异质性,总体预后不佳。LNK基因主要表达在造血细胞和组织上,在维持正常造血稳定的过程中有着不可替代的作用,参与了JAK/STAT(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription)等多条信号通路的调控。信号转导与转录活化蛋白3(signal transducerand activator of transcription 3,STAT3)是JAK/STAT信号通路中LNK基因的下游基因,是公认的致癌转录因子,参与了多种癌症和白血病的发生发展。本研究旨在了解急性髓系白血病患者中LNK基因、STAT3基因表达情况;探讨LNK基因沉默后对人急性单核细胞白血病THP-1细胞增殖的影响及对其下游基因STAT3的影响。方法:选取2015年1月--2016年1月间在我院初诊的AML患者30例为病例组,同期住院的非恶性疾病患者20例为对照组,分别收集骨髓2ml。提取RNA,逆转录为c DNA,设计LNK、STAT3基因引物,采用RT-PCR检测病例组和对照组LNK m RNA、STAT3 m RNA表达情况;提取蛋白,采用Western Blotting检测LNK、STAT3蛋白表达情况。培养THP-1细胞,以慢病毒为载体介导si RNA稳定沉默LNK基因;流式细胞术检测感染率;RT-PCR验证LNK沉默效应;CCK-8法检测THP-1细胞增殖情况;Western Blotting检测LNK、STAT3蛋白表达情况。结果:RT-PCR结果显示,AML患者的LNK m RNA和STAT3 m RNA水平较对照组均升高,差异有统计学意义(P0.05);Western Blotting结果显示,AML患者的LNK和STAT3蛋白表达水平明显高于对照组(P0.05),说明AML患者存在LNK和STAT3基因的高表达。LNK si RNA-EGFP重组慢病毒感染THP-1细胞的最佳MOI=100,在感染72小时时绿色荧光蛋白表达最强;流式细胞术检测各组感染效率均在95%以上,说明慢病毒感染THP-1细胞成功;RT-PCR检测各组LNK m RNA表达情况,结果显示,与对照组相比,空病毒组无明显改变(P0.05),各感染组LNK m RNA均显著下降(P0.05),提示LNK基因沉默成功;采用CKK-8法检测各组细胞增殖情况,与对照组相比,空病毒组细胞增殖无明显改变(P0.05),感染组细胞增殖速率明显下降(P0.05);Western Blotting结果显示,与对照组相比,空病毒组LNK、STAT3蛋白表达无明显改变(P0.05),感染组则显著下降(P0.01),沉默LNK后,LNK蛋白表达下降,同时伴有STAT3蛋白的下降,说明在THP-1细胞中,LNK表达的下降影响STAT3基因的表达,LNK基因对STAT3表达可能有促进作用。结论:1.AML患者中存在LNK、STAT3基因的高表达;2.以慢病毒为载体,采用si RNA技术可以成功沉默THP-1细胞的LNK基因;3.LNK沉默后,THP-1细胞增殖明显受阻,提示LNK基因可以促进急性髓系白血病细胞的增殖;4.LNK沉默后,STAT3蛋白表达显著下调,提示LNK基因可能影响STAT3的表达;目的:急性髓系白血病(AML)是一类恶性程度较高的血液肿瘤,目前的治疗主要以化疗为主。近年来,随着对急性髓系白血病发病机制认识的深入,各种联合化疗方案和支持治疗的日益完善,急性髓系白血病的预后有所改观。但是,化疗药物的多重耐药性、副作用等一系列问题,使得当前急性髓系白血病的治疗依然存在较大的困难,为此迫切需要寻找新的安全高效、少耐药、不良反应轻微的药物。青蒿琥酯(Artesunate,ART)是青蒿素的一种半合成衍生物,已在临床应用20余年,具有水溶性好,抗疟疗效高、安全性高等特点。近年研究表明,青蒿琥酯对多种肿瘤细胞有抗癌作用。本研究旨在探讨青蒿琥酯对急性髓系白血病是否具有抗白血病作用及其作用机制,为急性髓系白血病的治疗寻找新的药物。方法:培养THP-1细胞,选用5种浓度的青蒿琥酯处理THP-1细胞后,采用CCK-8法检测THP-1细胞的活力,流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western Blotting检测STAT3、caspase3、caspase8蛋白表达。将5周龄裸鼠随机分为实验组及对照组,实验组颈部皮下注射对数生长期的THP-1细胞1.5′106个/只,对照组颈部皮下注射PBS 0.1ml/只;待裸鼠皮下成瘤后,药物干预组腹腔注射不同浓度青蒿琥酯,生理盐水组腹腔注射等量生理盐水,观察瘤体的变化;待青蒿琥酯治疗结束1周后,处死裸鼠,取瘤体组织提取蛋白,Western Blotting法检测STAT3蛋白表达情况。结果:青蒿琥酯能明显抑制体外THP-1细胞的增殖,其效应呈剂量及时间依赖性;流式细胞术结果显示青蒿琥酯能增加THP-1细胞的凋亡;Western Blotting结果显示,青蒿琥酯显著下调STAT3蛋白表达,同时激活capase3和caspase8从而诱导细胞凋亡;实验组裸鼠接种THP-1细胞后4周皮下成瘤;与生理盐水组相比,腹腔注射青蒿琥酯能显著抑制瘤体的生长,且没有明显的不良反应。瘤体组织Western Blotting结果显示,青蒿琥酯下调了STAT3蛋白表达(P0.05)。结论:1.青蒿琥酯能够显著抑制THP-1细胞的增殖,提示青蒿琥酯对AML有抗白血病作用;2.青蒿琥酯作用于THP-1细胞后,STAT3蛋白表达下降,凋亡蛋白caspase3和caspase8表达上调,提示青蒿琥酯可能是通过下调STAT3基因的表达和激活caspase3和caspase8从而发挥抗白血病作用。3.THP-1细胞能在裸鼠皮下成瘤,青蒿琥酯腹腔注射有效抑制瘤体的生长,提示ART对THP-1细胞在体内亦有抗白血病作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：遵义医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R733.71

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本文编号：1493302