ACY1在肝细胞肝癌中的表达及作用机制研究

发布时间：2018-02-07 09:39

  本文关键词： 肝细胞肝癌 蛋白质组学 双向荧光差异凝胶电泳 氨基酰化酶1 细胞侵袭　出处：《浙江大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景： 肝细胞肝癌(Hepatocellular carcinoma, HCC)是常见的消化系统恶性肿瘤之 我国HCC的新增病例和死亡人数均居世界首位。因其起病隐匿,进展期快,恶性度高,预后极差,给人民健康和社会经济带来沉重负担。近些年随着对HCC治疗理念的不断认知,HCC规范化诊治的不断推广,以手术为主的综合治疗策略很大程度地减少了术后复发率、提高了患者生存率,但5年总体生存期仍不理想。如何更加有效地防治HCC成为进一步提高患者生存率的瓶颈问题。蛋白质是生命功能的执行者,以蛋白质表达水平,翻译后修饰,蛋白与蛋白相互作用为研究对象的蛋白质组学逐渐成为生命科学研究中的热点领域。其在肿瘤发生发展分子机制研究、诊断／预后分子标记物筛选、药物作用靶点与作用机制研究、细胞信号传导和蛋白分子功能研究等方面发挥着越来越重要的作用。 目的： 本研究旨在利用蛋白质组学筛选HCC组织与配对癌旁组织间差异表达的蛋白质,发现与HCC发生发展可能密切相关的关键蛋白。再通过大样本重点验证差异表达蛋白氨基酰化酶1(aminoacylase-1, ACY1)在HCC组织及配对癌旁组织、HCC患者血清与健康人血清中的表达水平,统计分析ACY1蛋白表达水平与HCC患者临床病理参数之间的关系。并在HCC细胞株中干扰或过表达ACY1,进一步明确ACY1在HCC细胞株中的生物学功能,最后利用基因芯片初步探究ACY1参与HCC发生发展的可能分子机制。 方法： 1.利用双向荧光差异凝胶电泳技术(two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis,2D-DIGE)筛选HCC组织及其配对癌旁组织间差异表达蛋白,并质谱鉴定。 2.收集128例HCC患者肿瘤组织及配对癌旁组织,利用实时荧光定量PCR、 Western免疫印迹、免疫组化等方法验证差异表达蛋白ACY1在HCC肿瘤组织及配对癌旁组织中的表达情况。根据ACY1在HCC组织中的蛋白表达水平,分析ACY1与HCC患者临床病理参数之间的关系。 3.收集21例健康人血清及40例HCC患者血清,利用酶联免疫吸附剂测定(ELISA)技术检测ACY1血清表达水平。 4.通过体外转染HCC细胞株SMMC7721(ACY1-siRNA)和BEL74O2(ACY1腺病毒)的方式,分别干扰或过表达ACY1,利用Cell Counting Kit-8(CCK-8)、流式细胞凋亡实验、流式细胞周期实验、细胞侵袭实验检测ACY1对HCC细胞增殖、凋亡、周期和侵袭能力的影响。在BEL7402细胞中过表达ACY1,通过裸鼠体内成瘤实验观察其对HCC细胞成瘤能力的影响。 5.在HCC细胞株SMMC7721中干扰ACY1表达,利用基因芯片技术进行差异表达基因的筛选,进一步探究ACY1参与HCC发生发展的可能分子机制。 结果： 1.本实验中2D-DIGE分析得到HCC组织及配对癌旁组织间差异表达蛋白30个(倍数改变≥1.5倍,p0.05),质谱鉴定得到ACY1、keratin8等差异蛋白11个(倍数改变≥2.5倍,p0.05)。 2.实时荧光定量PCR结果显示ACY1mRNA在HCC组织中表达水平明显低于配对癌旁组织(p0.05)。Western免疫印迹结果表明ACY1蛋白在HCC组织中表达水平同样明显低于配对癌旁组织。免疫组化结果分析提示ACY1组织蛋白表达水平与HCC患者血清甲胎蛋白(AFP)水平(p=0.033)及血管侵犯(p=0.027)密切相关,与患者性别、年龄、肿瘤大小、组织学分级无关。 3.血清ACY1表达水平在HCC患者中高于健康人(p0.05),提示ACY1是HCC诊断的潜在分子标记物。 4.体外细胞功能学实验表明干扰ACY1表达后,SMMC7721细胞的增殖能力与侵袭能力增强。过表达ACY1后,BEL7402细胞的增殖能力与侵袭能力减弱。裸鼠成瘤实验表明,过表达ACY1的BEL7402细胞株成瘤能力明显减弱。 5.基因芯片结果显示ACY1沉默表达引起1726个差异基因改变(倍数改变≥1.5倍,p0.05),差异基因主要分布在TGFP和MAPK等信号通路。干扰ACY1表达后,ERKl和TGFβ1蛋白表达水平升高。 结论： 1.相对于癌旁组织,HCC组织中ACY1蛋白表达水平下调,提示ACY1可能与HCC发生发展相关。 2.HCC患者血清ACY1表达水平高于健康人,提示ACY1具有作为HCC患者诊断分子标记物的潜在价值。 3.沉默ACY1表达可增强SMMC7721细胞的增殖及侵袭能力,过表达ACY1可抑制BEL7402细胞的增殖及侵袭能力。 4.ERK1和TGFβ1是ACY1参与HCC发生发展的重要靶分子。
[Abstract]:Background:
Hepatocellular carcinoma (HCC) is a common malignant tumor of the digestive system
New cases of HCC in our country and the number of deaths were ranked first in the world. Because of its insidious onset, progress fast, high malignancy and poor prognosis, to bring a heavy burden on people's health and social economy. In recent years with the continuous treatment of HCC cognitive concept, HCC standardized diagnosis and treatment of continuous promotion, comprehensive treatment strategies in operation the greatly reduced the postoperative recurrence rate and improve the survival rate of the patients, but 5 years overall survival is still not ideal. How to effectively prevent HCC problems become a bottleneck in improving the survival rate of patients. The protein is a vital function of the performer, the expression level of the protein, posttranslational modification, protein and protein the interaction of learning has become a hot topic in life science research for the proteome research object. The research development of molecular mechanism in cancer screening, diagnosis and prognosis of molecular markers and drug targets The research of point and action mechanism, cell signaling and protein molecular function are playing a more and more important role.
Objective:
The purpose of this study is to use proteomics screening of differentially expressed HCC tissue and paired adjacent tissue protein, found that the occurrence and development of key protein associated with HCC. Through large sample focus on the verification of differentially expressed proteins of aminoacylase 1 (aminoacylase-1, ACY1) in HCC tissues and paired adjacent, the expression level of serum patients with HCC in healthy human serum, the relationship between the statistical analysis of the expression level of ACY1 protein and HCC in patients with clinical pathologic parameters. And the interference in HCC cells or ACY1 expression, to further clarify the biological function of ACY1 in HCC cell line, finally using gene chip ACY1 to participate in the preliminary inquiry the possible molecular mechanism of the occurrence and development of HCC.
Method锛，

本文编号：1494074