MicroRNA-200a-3p靶向调控SPAG9基因对肾细胞癌生物学行为的影响

发布时间：2018-02-09 04:32

  本文关键词： microRNA-200a-3p SPAG9 肾细胞癌 增殖 细胞周期 凋亡 迁移 侵袭　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的:研究micro RNA-200a-3p对肾细胞癌细胞生长、凋亡、迁移、侵袭等生物学行为的影响及相关的作用机制,探寻治疗肾细胞癌的靶基因。方法:1.运用实时定量PCR方法,验证mi R-200a-3p在正常肾组织与肾细胞癌组织以及正常肾小管上皮细胞与肾细胞癌细胞中的表达情况。2.将mi R-200a-3p mimics转染肾细胞癌细胞786-O和ACHN细胞,通过MTT、平板克隆形成实验、transwell小室迁移和侵袭实验、PI单染检测细胞周期以及Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡等方法研究mi R-200a-3p对肾细胞癌细胞786-O、ACHN功能的影响。裸鼠皮下肾肿瘤模型分析mi R-200a-3p对肿瘤生长的影响。3.应用生物信息学软件预测mi R-200a-3p的靶基因,构建双荧光素酶报告基因验证mi R-200a-3p与其靶基因,运用实时定量PCR及western blot方法进一步验证靶向关系。4.运用实时定量PCR方法、免疫组织化学染色及免疫细胞化学染色验证SPAG9在正常肾组织与肾细胞癌组织以及正常肾小管上皮细胞与肾细胞癌细胞中的表达情况。5.将si-SPAG9转染肾细胞癌细胞786-O和ACHN细胞,通过MTT、平板克隆形成实验、transwell小室迁移和侵袭实验、PI单染检测细胞周期以及Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡等方法研究沉默SPAG9对肾细胞癌细胞786-O、ACHN功能的影响。将mi R-200a-3p mimics和pc DNA3.1-SPAG9质粒共转染入肾细胞癌细胞,设计“挽救”实验。6.查阅文献选择肿瘤恶性特征相关的基因,Western blot分析过表达mi R-200a-3p、敲除SPAG9及共转染mi R-200a-3p mimics和pc DNA3.1-SPAG9质粒对肾癌细胞786-O中p21、cyclin D1、bcl-2、Bax以及MMP9蛋白表达的影响。结果:1.相对于人正常肾组织,mi R-200a-3p在肾细胞癌组织中的相对表达水平明显下降,下降幅度约为53.2%(P0.001)。相对于人正常肾小管上皮细胞,mi R-200a-3p在肾细胞癌细胞系786-O与ACHN细胞中的相对表达水平也明显下降,下降幅度分别约为73.1%(P0.05)和82.6%(P0.01)。2.mi R-200a-3p mimics使786-O和ACHN细胞mi R-200a-3p的表达水平明显升高,分别是mi R-NC组的1067倍和889倍。MTT实验结果显示,细胞接种96孔板转染72h后,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,OD490值明显下降,增殖活性明显减低(P0.05)。克隆形成实验结果显示,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,形成克隆数目明显减少(P0.05)。流式细胞仪检测细胞周期结果显示,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,细胞周期G0/G1发生阻滞,S期细胞数降低(P0.05)。细胞凋亡结果显示,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,凋亡率明显增高(P0.01)。Transwell侵袭迁移实验结果显示,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,穿过PET膜的细胞数明显减少(P0.05)。动物实验结果显示,转染mi R-200a-3p组与NC对照组比较,皮下肿瘤体积明显减小(P0.01)。3.多个生物信息软件均预测到mi R-200a-3p种子序列与SPAG9 3'UTR互补结合。双荧光素酶报告基因实验结果显示,过表达mi R-200a-3p明显降低野生型SPAG93'UTR的荧光素酶活性,而对突变型SPAG9 3'UTR无明显影响。过表达mi R-200a-3p的细胞和mi R-200a-3p干预的裸鼠皮下肿瘤标本中SPAG9明显下调。4.相对于人正常肾组织,SPAG9在肾细胞癌组织中的相对表达水平明显升高,升高幅度约为正常的4倍(P0.001)。相对于人正常肾小管上皮细胞,SPAG9在肾细胞癌细胞系786-O与ACHN细胞中的相对表达水平也明显升高,升高幅度分别约为正常的4.21倍(P0.01)和6.25倍(P0.01)。免疫组织细胞化学也显示了相同的结果。5.沉默SPAG9显著减弱了肾细胞癌细胞的增殖活性(P0.05)、形成克隆数目(P0.05)、穿过PET膜的细胞数(P0.05),却显著升高凋亡率(P0.01),也使细胞周期G0/G1发生阻滞,S期细胞数降低(P0.05),这些作用与过表达mi R-200a-3p相似。而且mi R-200a-3p的作用也可被SPAG9过表达质粒所中和。6.Western blot实验结果显示,过表达mi R-200a-3p和敲除SPAG9均能抑制肾细胞癌细胞的cyclin D1、bcl-2和MMP9的表达,增强p21和Bax的表达,且过表达mi R-200a-3p的作用可被pc DNA3.1-SPAG9中和。结论:mi R-200a-3p在肾细胞癌中的低表达特征可作为肾细胞癌诊断的肿瘤标志物。mi R-200a-3p在肾细胞癌中作为一个抑癌基因可以显著抑制肿瘤的增殖、侵袭,促进肿瘤的凋亡。mi R-200a-3p在肾细胞癌中通过靶向调控SPAG9基因而发挥抗肿瘤作用。mi R-200a-3p的抑癌作用机制有待于更加深入的研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11

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本文编号：1497083