miR-223靶向调控p120对结肠癌生物学行为的影响及其分子机制

发布时间：2018-02-09 04:18

  本文关键词： 结肠癌 miR-223 p120 miR-223 p120 E-cadherin RhoA β-catenin　出处：《华中科技大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分miR-223与p120在结肠癌中的表达特征及二者之间靶向调控关系的鉴定目的探索miR-223和p120 catenin (p120)在结肠癌组织中的表达,分析二者表达与临床病理特征之间的关系,以及二者表达之间的相关性,预测p120为miR-223靶基因的可能性。方法采用免疫组织化学法检测80例结肠癌组织和42例对应癌旁正常结肠组织中p120的表达分布情况；采用Real Time PCR检测18例结肠癌组织和对应正常结肠组织中miR-223的表达情况,并分析其与临床病理特征之间的关系,及二者表达之间的相关性。利用生物信息学分析,预测p120为miR-223靶基因的可能性；采用双荧光素酶报告实验予以验证。进一步在人类结肠癌LoVo细胞中过表达miR-223类似物,分别用Real Time PCR和Western blot检测p120 mRNA和蛋白表达水平予以验证。结果(1)免疫组化显示：在结肠癌组织和正常结肠组织中,p120异常表达率分别为71.25%和0%(P0.05),两组间差异具有统计学意义。(2)在低分化癌、中分化癌和高分化癌组织中p120异常表达率分别为91.67%、43.48%和33.33%(P0.05),在有淋巴结转移和无淋巴结转移的组织中p120异常表达率分别为85.29%和60.87%(P0.05),在Dukes分期C-D期的患者和A-B期的患者中p120异常表达率分别为85.71%和58.70%(P0.05),组间p120异常表达率差异均具有统计学意义；而p120异常表达率在不同年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤位置、浸润深度等情况之间的差异无统计学意义(P0.05)。(3) Real Time PCR显示：miR-223在结肠癌组织中的表达量较正常结肠组织高,两组间比较有统计学差异(P0.05);且miR-223表达量在低分化癌组织中显著高于中分化和高分化癌组织(P0.05),在浸润深度为T4的组织中显著高于T1-T3的组织(P0.05),在有淋巴结转移的组织中显著高于无淋巴结转移的组织(P0.05),在Dukes分期C-D期的组织中显著高于A-B期的组织(P0.05)。(4)在结肠癌组织中,p120的表达与miR-223的表达呈负相关(r=-0.575,P=0.013)。(5)生物信息学数据库TargetScan和MicroRNA.org都预测miR-223的5’种子区域可以与p120mRNA的3'UTR区域互补结合。双荧光素酶报告实验显示：与阴性对照组相比,在共转染miR-223类似物的条件下,p120-3'UTR WT载体荧光素酶活性下降(P0.05),而p120-3'UTR Mut载体荧光素酶活性无统计学差异(P0.05)。(6)在人类结肠癌LoVo细胞中转染miR-223类似物后,与阴性对照组相比,Real Time PCR显示p120 mRNA表达水平显著降低(P0.001); Western blot显示p120的蛋白表达水平也显著降低(P0.05)。结论miR-223的表达增高和p120的表达异常都与结肠癌的恶性程度相关,且p120与miR-223表达呈负相关,在结肠癌的发生发展过程中,miR-223可能通过靶向肿瘤抑制因子p120,负性调节p120表达,从而促进结肠癌细胞的恶性生物学行为。第二部分miR-223对LoVo结肠癌细胞生物学行为的影响及其机制研究目的观察miR-223对LoVo细胞生物学行为的影响,并初步探讨其对下游信号通路的调节作用,以明确miR-223作为一个癌基因的分子机制。方法在LoVo细胞中转染miR-223类似物或者抑制剂,采用MTT法观察其对LoVo细胞增殖能力的影响;采用细胞划痕实验和Transwell细胞迁移实验观察其对细胞迁移能力的影响；采用基质胶侵袭实验观察其对细胞侵袭能力的影响。并应用Western blot检测其对E-cad和VIM表达的影响;采用G-LISA检测其对RhoA活性的影响；采用核浆蛋白分离提取、免疫荧光等方法检测其对β-catenin入核的影响；采用Western blot和Real Time PCR检测其对c-Myc和CyclinD1的蛋白表达,以及对MMP7的mRNA和蛋白表达水平的影响。结果(1)MTT结果显示：在转染miR-223类似物组,细胞增殖能力较阴性对照组增强,而转染miR-223抑制剂组细胞增殖能力较阴性对照组减弱。(2)细胞划痕实验显示：与阴性对照组相比,划痕48 h后,转染miR-223类似物组细胞划痕之间出现两侧细胞互相融合的现象,而转染miR-223抑制剂组细胞划痕之间仍有较大面积。(3) Transwell细胞迁移实验显示：与阴性对照组相比,转染miR-223类似物组迁移细胞数量增多,而转染miR-223抑制剂组迁移细胞数量减少。(4)基质胶侵袭实验显示：与阴性对照组相比,转染miR-223类似物组穿过基质胶的细胞数量增多,而转染miR-223抑制剂组穿过基质胶的细胞数量减少。(5) Western blot结果显示：转染miR-223类似物组p120表达降低、E-cad表达也降低,而VIM表达增加；转染miR-223抑制剂组p120表达增加,而E-cad和VIM无明显改变。(6) G-LISA检测结果显示：转染miR-223类似物和p120 siRNA组,RhoA的活性明显增加。(7)核浆蛋白分离提取结果显示：转染miR-223类似物组细胞核中β-catenin的表达增加；免疫荧光结果显示,转染miR-223类似物组β-catenin入核增加。(8) Western blot和Real Time PCR结果显示：转染miR-223类似物组c-Myc和CyclinD1的蛋白表达增加：且MMP7的mRNA和蛋白表达水平都增加。结论miR-223可能通过靶向p120降低细胞间粘附、增强RhoA活性、激活β-catenin信号通路而促进结肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭。
[Abstract]:The expression of miR - 223 and p120 in colon cancer tissues and the correlation between the expression of miR - 223 and p120 in normal colon tissues were analyzed . ( 4 ) The expression of miR - 223 was negatively correlated with the expression of miR - 223 in colon cancer tissues ( r = - 0.575 , P = 0 . 013 ) . ( 4 ) Compared with the negative control group , the number of cells transfected with miR - 223 analog group increased and the number of cells transfected with miR - 223 inhibitor group decreased . ( 8 ) Western blot and Real Time PCR showed that the expression of c - Myc and Cyclin D1 transfected with miR - 223 increased : and the mRNA and protein expression levels of MMP - 7 increased . Conclusion miR - 223 may promote the proliferation , migration and invasion of colon cancer cells by targeting p120 to reduce inter - cell adhesion , enhance RhoA activity , and activate the 尾 - catenin signaling pathway .

【学位授予单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.35

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本文编号：1497053