CpG位点选择对焦磷酸测序法检测肝癌SMP30启动子甲基化的影响

发布时间：2018-02-13 03:00

  本文关键词： 肝癌 衰老标记蛋白 甲基化 焦磷酸测序　出处：《山东医药》2017年09期 　论文类型：期刊论文

【摘要】：目的选择适宜的CpG位点用于焦磷酸测序法检测肝癌衰老标记蛋白30(SMP30)启动子甲基化。方法提取人肝癌细胞系SMCC-7721和BEL-7404的基因组DNA,设计针对SMP30基因序列1和序列2的扩增和测序引物,焦磷酸测序法检测SMP30基因序列1和序列2中的CpG位点甲基化程度,并用Sanger测序法验证序列2中出现的SNP位点。结果 SMCC-7721和BEL-7404细胞系中,SMP30基因序列1中6个CpG位点低甲基化,与SMP30基因低表达不符,且测序结果质量评估均为失败。SMP30基因序列2中6个CpG位点高甲基化,与SMP30基因低表达相符,前2个CpG位点均为通过,而后4个CpG位点均为失败。去除第5和第6个CpG位点,只检测SMP30基因序列2中poly(T)结构前4个CpG位点,SMCC-7721细胞系中甲基化程度分别为100%、90%、100%和80%;BEL-7404细胞系中甲基化程度分别为100%、92%、100%和77%。除第3个CpG位点为失败,其余CpG位点均为通过。Sanger测序显示SMCC-7721和BEL-7404细胞系在第3个CpG位点前存在SNP位点,且均为A。结论焦磷酸测序时选择靠近基因转录起始点上游且在poly(T)结构之前的CpG位点,测得的SMP30启动子甲基化值较准确。
[Abstract]:Objective to select suitable CpG loci for the detection of promoter methylation of aging marker protein 30 (SMP30) of hepatocellular carcinoma by pyrosequencing. Methods the genomic DNAs of human hepatoma cell lines SMCC-7721 and BEL-7404 were extracted, and primers for amplification and sequencing of SMP30 gene sequences 1 and 2 were designed. The methylation of CpG loci in sequence 1 and 2 of SMP30 gene was detected by pyrosequencing, and the SNP loci in sequence 2 were identified by Sanger sequencing. Results six CpG loci in sequence 1 of SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines were hypomethylated. The results showed that 6 CpG loci in the failed SMP30 gene sequence 2 were hypermethylated, which were consistent with the low expression of SMP30 gene, and the first two CpG loci were passed. The last four CpG loci were all failed. The 5th and 6th CpG loci were removed. The methylation degree of SMCC-7721 cell line was 100% and 100% respectively in SMCC-7721 cell line. The methylation degree of SMCC-7721 cell line was 100% and 77%, respectively, except for the third CpG locus. The other CpG loci were SNP loci in SMCC-7721 and BEL-7404 cell lines in front of the third CpG locus by Sanger sequencing, and they were both SNP loci. Conclusion in pyrosequencing, CpG sites close to the upstream of the transcription start point and prior to the polytetral structure are selected for pyrosequencing. The methylation values of SMP30 promoter were more accurate.
【作者单位】： 广西医科大学;
【基金】：国家自然科学基金委员会资助项目(81460432)
【分类号】：R735.7

【参考文献】

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本文编号：1507170