甲基化转移酶SETDB1及cNOTCH1受体蛋白在结直肠癌中的功能及分子机制初步研究

发布时间：2018-02-13 18:45

本文关键词： 结直肠癌组蛋白甲基化 SETDB1 TP53 NOTCH1 STAT1 ~*cNOTCH1 cleavage NOTCH1 蛋白(NOTCH1 的活化状态)　出处：《南方医科大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：目的及意义结直肠癌是消化道常见恶性肿瘤之一,近年来随着生活节奏的加快、饮食及环境的改变,我国结直肠癌的发病率有上升的趋势[1,2]。受社会经济发展和检测方法等的制约,许多患者没有得到准确的个体化治疗[3-5],治疗获益少,错过了治疗的最佳时机,增加了家庭负担,浪费了社会医疗成本。因此,寻找结直肠癌发生发展过程中的关键基因,深入研究其功能机制,具有重要的临床意义及社会效益。SETDB1主要参与组蛋白H3K9的三甲基化过程,通常引起基因的沉默或转录性抑制[6-9]。近年来的研究发现,SETDB1蛋白的异常表达与多种肿瘤的发生发展存在着十分密切的关系[10-15]。目前未有SETDB1蛋白在结直肠癌中的表达研究,我们的前期研究结果发现SETDB1蛋白在结直肠组织中存在高表达情况,提示其表达也同结直肠癌发生发展存在联系,但其分子机制仍不明确。NOTCH1是NOTCH信号通路的受体之一[16],NOTCH通路的异常活化参与了多种肿瘤的发生发展过程[17-20],同时NOTCH通路的激活在肿瘤形成的过程中也可以起抑制作用[21,22],深入研究的结果提示,在结直肠癌中这种抑制作用可能同组蛋白甲基化抑制及NOTCH/WNT通路交互作用有一定关系,但其作用的具体分子机制尚不明确[23]。因此本研究将进一步观察SETDB1及NOTCH1蛋白在结直肠癌组织中的表达情况,探索其功能的分子机制,为结直肠癌个体化治疗提供理论依据。材料及方法1、利用Western blot、荧光实时定量PCR及免疫组织化学等技术检测SETDB1蛋白在结直肠癌细胞系、新鲜组织及石蜡切片中的表达情况,并分析SETDB1的表达同预后关系;2、建立SETDB1蛋白过表达及干扰的结直肠癌细胞稳定株,利用CCK8、平板克隆形成实验及裸鼠皮下成瘤实验检测稳定株的体内外增值能力的变化,利用细胞划痕实验、Transwell小室检测稳定株的体外迁移能力的变化,利用流式细胞技术检测稳定株的凋亡及周期变化;3、利用5-氟尿嘧啶(5-Fu)诱导结直肠癌细胞凋亡,利用流式细胞技术检测SETDB1干扰及过表达细胞株的抗凋亡能力变化,利用Western blot技术检测TP53、BCL2、BAX等凋亡相关基因的变化,利用CHIP-PCR技术检测TP53基因启动子SETDB1结合位点;4、利用Western blot、免疫组织化学技术检测SETDB1蛋白及cNOTCH1蛋白在结直肠癌细胞系及石蜡切片中的共表达情况,并分析SETDB1及cNOTCH1不同的表达组合与组织预后的关系;5、利用NOTCH1激活剂(多西环素)及抑制剂(Y-分泌酶抑制剂,DAPT)作用于SETDB1不同表达情况的细胞株,利用CCK8及平板克隆形成实验检测处理细胞株的体内外增值能力的变化,利用细胞划痕实验、Transwell小室检测处理细胞株的体外迁移能力的变化;6、利用基因芯片技术探索在NOTCH活化的结直肠癌细胞株中SETDB1干扰后相关基因变化,利用Western blot技术验证STAT1表达情况。结果1、SETDB1在结直肠癌中的表达情况1)相对于正常结肠上皮细胞株(NCM460细胞株),SETDB1在数种结肠癌细胞株内均有不同程度的上调;8例结直肠癌组织中SETDB1蛋白的表达水平高于相匹配的癌旁组织;2)SETDB1阳性表达主要定位于细胞核,呈不同程度的黄褐色,在46.7%(14/30)的结直肠癌组织中呈强阳性表达,其中高中分化组强阳性比例达到55%,低分化组强阳性比例为30%;3)选取结直肠癌石蜡切片102例检测SETDB1的表达,采用Kaplan-meier法进行生存分析,结果显示,结直肠癌组织中SETDB1低表达组年总体生存率显著高于高表达组,具有统计学差异。2、SETDB1表达在结直肠癌中功能的体内外验证1)构建SETDB1过表达及干扰慢病毒载体,成功构建SETDB1过表达及干扰稳定结直肠癌细胞株,采用Western blot、荧光实时定量PCR检测过表达及干扰效率;2)SETDB1过表达后显著增加结直肠癌细胞的增殖及迁移能力;3)干扰SETDB1表达后结直肠癌细胞的增殖及迁移能力明显减弱。3、SETDB1表达对结直肠细胞凋亡的影响1)SETDB1过表达及干扰组细胞相对于对照组细胞,凋亡率均未有明显变化,干扰组细胞相对于对照组细胞出现明显的G2期阻滞,过表达组未有明显变化;2)5-Fu诱导凋亡后,SETDB1过表达组相对于对照组,凋亡率明显减少,TP53表达较少,而干扰组明显增加,TP53表达显著增加。BAX及BCL-2未有明显变化;3)SETDB1过表达组相对于对照组,H3K9三甲基化明显增多,CHIP-QPCR结果显示,TP53启动子区域SETDB1结合位点。4、SW480细胞株SETDB1干扰后细胞增殖及迁移能力增强。5、结直肠癌组织中SETDB1及cNOTCH1共表达情况1)选取与检测SETDB1表达水平同样的102例石蜡切片检测cNOTCH1共表达情况,结果显示:SETDB1的阳性例数为79例占77.45%,cNOTCH1的阳性例数为47例占46.08%,cNOTCH1的表达与预后之间呈负相关;2)根据2种蛋白的表达情况,我们将结直肠癌组织分成4个小群,然后观察他们的表达情况同预后的关系,结果表明,SETDB1(+)cNOTCH1(-)及SETDB1(-)cNOTCH1(-)与预后之间呈负相关;3)DLD1 细胞株表达为 SETDB1(-)cNOTCH1(-),SW480 细胞株表达为 SETDB1(+)cNOTCH1(+)。6、NOTCH1激活剂(多西环素)及抑制剂(γ-分泌酶抑制剂,DAPT)作用后的细胞增殖迁移能力变化1)应用NOTCH1激活剂后,细胞内HES1表达增高,DLD1细胞株处理组较未处理组细胞增值及迁移能力增强而SETDB1过表达的DLD1细胞株得到反向结果;2)应用NOTCH1抑制剂,细胞内HES1表达下降,SW480细胞株处理组较未处理组细胞生长速度加快而SETDB1干扰的SW480细胞株得到反向结果。7、基因芯片检测相对于对照组细胞,SW480细胞株SETDB1干扰后有279个基因上调,204个基因出现下调。8、STAT1在SW480细胞中的表达情况Western blot检测结果显示,SW480细胞株SETDB1干扰后STAT1细胞出现明显下调。结论1、SETDB1在结直肠癌组织及细胞中明显上调,其表达水平同临床预后相关;2、SETDB1过表达后显著增加结直肠癌细胞的增殖及迁移能力,干扰SETDB1表达后结直肠癌细胞的增殖及迁移能力明显减弱;3、SETDB1表达上调后通过下调结直肠癌细胞TP53表达促进结直肠癌的发生发展;4、SETDB1表达功能受NOTCH1蛋白活化状态的影响,两者不同的表达组合影响结直肠癌细胞的增值及迁移能力及临床预后;针对NOTCH1的治疗药物疗效随SETDB1不同的表达状态发生变化,提示其药物选择个体化的需要。5、NOTCH1蛋白活化状态下,SETDB1通过上调STAT1表达抑制结直肠癌细胞增值迁移。
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【学位授予单位】：南方医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.3

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