干扰素诱导跨膜蛋白3在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌细胞增殖的影响

发布时间：2018-02-14 08:48

本文关键词： 乳腺癌干扰素诱导跨膜蛋白3 RNAi 增殖能力　出处：《吉林大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：随着早期预防、早期诊断及靶向治疗的不断发展,乳腺癌的发病率已经逐渐下降而且生存率在逐步提升,但乳腺癌仍是世界范围内重大健康问题,是女性最常见的肿瘤。乳腺癌的发生、复发及对治疗的耐受机制等诸多问题仍有待于进一步阐明。干扰素诱导跨膜蛋白(IFITM)是1984年首先由Friedman等发现,属于小分子干扰素诱导基因(ISGs)家族成员。迄今,在人体内IFITMs有5个家族成员,分别为IFITM1、IFITM2、IFITM3、IFITM5和IFITM10,均位于11(11p15.5)号染色体上。该基因家族主要编码125-133个氨基酸,其中包括2个跨膜区域。IFITM5主要参与骨特异性矿物化调节,IFITM10目前所知不多。干扰素诱导跨膜蛋白1、2、3是重要的抗病毒蛋白,可以抑制多种入侵的致病病毒,如HIV病毒、流感病毒、水泡性口炎病毒等。同时,某些种属的IFITMs蛋白涉及多个细胞代谢过程,包括免疫细胞的调节、体节发生、生殖细胞的归巢和成熟、细胞增殖和心肌细胞的发育。然而,最近研究发现IFITMs在肿瘤发展中也扮演了重要角色,而不同肿瘤类型内IFITM表达水平可表现为显著上调或下调。IFITMs在结肠癌组织中高表达,同时胃癌细胞系也伴有IFITM1蛋白的高表达。而在人类黑素瘤细胞系基因表达的筛选中,某些细胞系内IFITM表达却下降。Wang等证实IFITM2蛋白在HER-2过表达的鼠乳腺癌中显著升高,Abba MC等在乳腺癌基因表达分析中发现浸润性乳腺癌比导管内原位癌中的IFITM3基因表达亦升高。虽然IFITM3在肿瘤的研究近年得到人们的关注,但是IFITM3在乳腺癌中的表达、相关作用及相关机理仍没有阐明。本研究以IFITM3为研究靶点,检测乳腺癌根治术切除标本中IFITM3蛋白的表达,同时以配对癌旁乳腺组织为对照,分析乳腺癌IFITM3表达与乳腺癌发生、预后密切相关蛋白(即ERα、PR和HER-2等)在乳腺癌组织中的相关性,及分析乳腺癌IFITM3表达与乳腺癌患者各临床特点可能的关系。在此基础上,利用慢病毒介导的sh RNA,沉默乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231内源IFITM3表达,观察其对乳腺癌细胞株细胞增殖能力等改变,并探索其相关作用机制。方法:1、乳腺癌组织中IFITM3的表达:收集81例乳腺癌根治术病例,免疫组织化学染色方法检测乳腺癌中IFITM3的表达,分析乳腺癌中IFITM3表达及其临床病理意义;2、沉默乳腺癌细胞系内源性IFITM3基因:利用Real-time PCR对5株体外培养的乳腺癌细胞中IFITM3的表达进行检测,筛选相对高表达IFITM3的乳腺癌细胞株后,利用慢病毒介导的RNAi,抑制乳腺癌细胞系内源性IFITM3表达,并以Real-time PCR和Western Blot方法分别在m RNA和蛋白水平上鉴定IFITM3基因的沉默效率;3、沉默IFITM3基因后对乳腺癌细胞增殖的改变:利用MTT法、Brdu掺入实验、流式细胞术、平板克隆形成实验研究下调IFITM3表达对乳腺癌细胞增殖的影响;并利用Western Blot检测下调IFITM3表达后细胞周期相关蛋白表达改变;4、沉默IFITM3基因后对乳腺癌细胞迁徙及侵袭能力的改变:利用细胞划痕实验及Transwell侵袭实验研究下调IFITM3表达对乳腺癌细胞的影响;并利用Western Blot检测下调IFITM3表达后MMP-9蛋白表达变化;5、雌激素及雌激素受体拮抗剂对乳腺癌MCF-7细胞IFITM3的影响:溶剂对照、1n M 17β-雌二醇(E2)、1μM 4-羟基三苯氧胺(4-hydroxytamoxifen,4-OHT)及1μM氟维司琼(Fulvestrant,ICI 182780)孵育雌激素依赖型乳腺癌细胞系MCF-724小时后,Real-time PCR检测IFITM3 m RNA的变化。结果:1、收集的81例乳腺癌组织中包含导管内原位癌(DCIS)32例,浸润性导管癌(IDC)49例,以及配对癌旁乳腺组织为对照,免疫组化结果显示IFITM3表达于细胞浆内。在32例DCIS组中,9例(28.12%)癌组织内IFITM3表达强阳性,13例(40.63%)为阴性;其配对癌旁乳腺组织仅有3例IFITM3(9.38%)表达强阳性,阴性表达为21例(65.62%);原位癌组织内IFITM3的强阳性表达与其ERα、PR、HER-2的表达以及患者的年龄未见有明确的相关性。而49例IDC组中,29例(59.18%)癌组织内IFITM3表达强阳性,5例(10.20%)阴性,其配对癌旁乳腺组织仅有4例(8.16%)IFITM3表达为强阳性,28例(57.14%)为阴性;IDC组织内IFITM3的强阳性表达与癌组织ERα、PR的表达呈现显著相关性,而与癌组织中HER-2、Ki67、P53、EGFR、CK14的表达未见相关性;同时癌组织内IFITM3的过表达与患者的年龄、肿瘤大小、淋巴结转移以及肿瘤的组织学分级未见相关性。2、Real-time PCR方法检测5种乳腺癌细胞内源性IFITM3 m RNA表达,结果显示:乳腺癌细胞系MCF-7、MDA-MB-231内有相对高的IFITM3 m RNA表达。利用含有IFITM3 sh RNA的重组慢病毒成功沉默了乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231中IFITM3的表达。3、MTT细胞生长曲线结果显示,沉默IFITM3第5天,与对照组相比si-IFITM3组OD490nm值显著下降,MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖受到抑制;Brd U掺入实验结果显示,Brd U掺入72h时后,与对照组相比si-IFITM3组MCF-7和MDA-MB-231细胞系的OD490nm吸光率下降;流式细胞仪检测细胞周期显示:si-IFITM3组与其相应的对照组细胞相比,MCF-7和MDA-MB-231细胞处于相对静止G0/G1期的细胞百分比增加,处于DNA合成的S期的细胞减少;克隆形成实验显示,si-IFITM3组与相应的对照组相比,MCF-7和MDA-MB-231细胞系克隆形成能力下降;沉默IFITM3基因后下调MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞Cyclin D1、CDK4表达,上调CDKN1A(P21)表达;4、同时,IFITM3表达下调后乳腺癌细胞系MCF-7和MDA-MB-231与其相应的对照组相比细胞迁移速度降低,细胞穿过Matrigel胶的侵袭能力降低;沉默IFITM3基因后MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞MMP-9表达下调;5、17β-雌二醇(E2)和4-羟基三苯氧胺(4-OHT)加药组比溶剂对照组乳腺癌MCF-7细胞的IFITM3 m RNA表达显著升高;而氟维司琼(ICI 182780)加药组比溶剂对照组乳腺癌MCF-7细胞的IFITM3 m RNA表达下降。结论:1、人乳腺癌组织内IFITM3的强阳性表达率显著高于配对癌旁乳腺组织。乳腺浸润性导管癌中,癌组织内IFITM3的强阳性表达与癌组织中ERα、PR表达呈明显正相关性。2、体外沉默IFITM3后,明显降低了乳腺癌细胞株体外细胞增殖能力,使乳腺癌细胞阻滞在G0/G1期,降低Cyclin D1、CDK4蛋白,上调P21蛋白表达。3、体外沉默IFITM3后,明显降低了乳腺癌细胞体外细胞迁移及侵袭能力,下调MMP-9蛋白表达。4、雌激素及雌激素受体拮抗剂显著影响ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7内IFITM3表达。这些结果提示IFITM3在乳腺癌细胞增殖、侵袭中发挥重要的调节功能,IFITM3表达与乳腺癌的发生、发展密切的相关性。
[Abstract]:The expression of IFITM3 and IFITM3 in breast cancer have been significantly increased or down - regulated . The effects of IFITM3 on proliferation of breast cancer cells were studied by MTT assay , Brdu incorporation assay , flow cytometry and plate cloning . Results : 1 . The expression of IFITM3 in breast cancer cells was regulated by Western Blot . The expression of IFITM3 mRNA in MCF - 7 and MDA - MB - 231 cells in breast cancer cell line MCF - 7 and MDA - MB - 231 was significantly decreased compared with control group . In vitro silencing IFITM3 , the expression of IFITM3 in breast cancer cell line MCF - 7 was significantly decreased and the expression of MMP - 9 protein was downregulated . The results suggested that IFITM3 plays an important role in regulating the proliferation and invasion of breast cancer cells .

【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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