ROS对乳腺癌上皮细胞极性变化及单核细胞浸润调控机制的研究

发布时间：2018-02-14 22:15

本文关键词： ROS 细胞极性单核细胞浸润乳腺癌 3D细胞培养　出处：《吉林大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景:细胞极性(Cell Polarity)是正常上皮组织的基本特征,细胞极性的破坏是乳腺癌发生过程中的一个早期细胞事件。细胞极性破坏将导致组织结构紊乱、增加乳腺癌的发生易感性并最终形成乳腺癌,而ROS水平的升高和相关的氧化应激是乳腺癌发生和发展的驱动力,诱导DNA、脂质、蛋白质和其它细胞成分的氧化性损伤并引起乳腺细胞向恶性转化,但目前国内外的研究还缺少ROS水平是否决定上皮细胞极性的维持、是否决定单核细胞的浸润的证据。目的:探讨乳腺正常极化腺泡结构的破坏及单核细胞浸润与ROS水平升高的关联性,证实ROS水平升高破坏乳腺上皮细胞极性后促进单核细胞的浸润,进而明确ROS对乳腺癌上皮细胞极性变化及单核细胞浸润调控的机制。方法:1.应用体外3D培养系统模拟体内生理微环境,3D培养HMT-3522人乳腺癌细胞系(包括极化的S1细胞和非极化的T4-2细胞)和MCF-10A人正常乳腺上皮细胞,荧光显微镜观察基底标志物α6-integrin在细胞中的表达分布情况来评估细胞极性,细胞增殖标记物Ki-67阳性率来评估细胞增殖情况,Cell ROX Deep Red红色荧光强度来评估细胞内ROS水平。2.分别应用表皮生长因子受体抑制剂Tyrphostin AG1478(TYR)、基质金属蛋白酶抑制剂GM6001(GM)或PI3K抑制剂LY294002(LY)处理3D培养的极性紊乱的T4-2细胞(非极化),使其结构逆转恢复为正常的T4R细胞(极化)。实时活细胞染色(Cell ROX Deep Red)检测比较S1/T4R细胞和T4-2细胞ROS水平。3.分别包装过表达RAC1 L61(破坏细胞极性)的慢病毒和过表达Myr-Akt(促进细胞增殖)的慢病毒,并感染S1、T4R或MCF-10A细胞,观察细胞极性和细胞增殖的变化,以确定ROS水平升高引起的细胞极性破坏是否依赖于细胞增殖。4.使用抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)或还原型谷胱甘肽(L-glutathione Reduced,GSH)降低非极化的T4-2细胞ROS水平,使用葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase,GO)升高极化的S1细胞或MCF-10A细胞ROS水平,以确定ROS水平变化对乳腺极化腺泡结构形成的影响。5.HMT-3522细胞/MCF-10A细胞与单核细胞(GFP标记的THP-1细胞、CMFDA标记的人CD14+原代单核细胞)体外3D共培养,荧光显微镜观察单核细胞浸润的程度,以确定升高ROS水平破坏极化腺泡结构后对单核细胞浸润的影响。6.利用荧光素酶报告基因表达系统和免疫印迹法(Western Blot)检测NF-κB活性。分别采用实时荧光定量PCR和ELISA方法检测3D培养中的非极化的T4-2细胞和极化的S1/T4R细胞的细胞因子表达水平,以确定ROS水平升高引起的细胞极性破坏是否通过激活NF-κB提高细胞因子的表达并促进单核细胞浸润。7.应用海马细胞能量代谢实时测定仪(Seahorse XF96)检测S1细胞和T4-2细胞耗氧率(Oxygen Consumption Rate,OCR)并结合实时荧光定量PCR和免疫印迹法检测S1细胞和T4-2细胞NDUFA11表达水平,以探讨非极化乳腺癌细胞ROS水平升高的机制。结果:1.乳腺癌上皮细胞极性变化与ROS水平的关系:实时活细胞染色检测结果显示,非极化的乳腺癌T4-2细胞ROS水平显著高于极化的S1细胞,是S1细胞的1.96倍(p0.05);TYR、GM或LY逆转T4-2细胞极性后ROS水平随之明显下降,分别降低至40%、53%、59%(p0.05)。2.乳腺癌上皮细胞极性破坏与细胞增殖:(1)过表达RAC1 L61能显著提高TYR处理的T4-2细胞ROS水平(p0.05),同时抑制TYR引起T4-2细胞极性的逆转(p0.001),但对细胞增殖的影响很小(p=0.42);过表达Myr-Akt显著的促进了TYR处理的T4-2细胞增殖(p0.001),但对ROS水平的影响并不明显(p=0.07)。(2)极化的S1细胞过表达RAC1 L61后,细胞极性破坏,与对照相比ROS水平明显升高(p0.05);过表达Myr-Akt后与TYR处理的T4-2细胞类似,只促进了细胞增殖但并不明显影响ROS水平(p=0.09)。(3)极化的MCF-10A细胞过表达RAC1 L61后,细胞的极性消失,与对照相比ROS水平明显升高(p0.001);过表达Myr-Akt后与TYR处理的T4-2细胞类似,只促进了细胞增殖并不明显影响ROS水平(p=0.10)。3.ROS水平升高与腺泡极化结构的形成:抗氧化剂NAC或GSH处理T4-2细胞使ROS水平显著降低(p0.01),重编T4-2细胞使其恢复形成极化的腺泡球体结构(p0.001),同时细胞增殖水平显著下降(p0.001);GO处理S1细胞升高了ROS水平(p0.001),并破坏了极化腺泡的形成(p0.001);GO处理MCF-10A细胞升高了ROS水平(p0.001),并破坏了极化腺泡的形成(p0.05)。4.腺泡极化结构破坏后对单核细胞浸润的影响:乳腺上皮细胞与单核细胞3D共培养,非极化的乳腺癌T4-2细胞可招募单核细胞浸润,应用抗氧化剂NAC或GSH降低T4-2细胞ROS水平恢复其极性后能够明显抑制单核细胞浸润(p0.001);极化的S1细胞招募单核细胞能力差,应用GO升高S1细胞ROS水平破坏其极性结构后可显著促进单核细胞浸润(p0.001)。5.ROS水平对乳腺癌细胞NF-κB活性和细胞因子表达的影响:(1)荧光素酶活性检测结果显示,3D培养的T4R细胞NF-κB活性较T4-2细胞明显降低,NAC处理T4-2细胞后NF-κB活性随之明显降低。(2)Western Blot检测结果显示,与极化的S1细胞相比,非极化的T4-2细胞磷酸化p-65(p-p65,Ser536位点)水平升高至2.50倍(p0.05),核蛋白p65表达水平升高至1.43倍(p0.05);TYR处理T4-2细胞逆转其极性后,p-p65和核蛋白p65表达水平分别降低至60%、50%(p0.05);NAC处理T4-2细胞,p65磷酸化水平下降至50%并降低核蛋白p65水平至原来的40%(p0.05)。(3)实时荧光定量PCR检测结果显示,与极化的S1细胞相比,非极化的T4-2细胞因子IL-24、CXCL1、CXCL3和CXCL8m RNA表达水平分别升高至131倍、78倍和21倍(p0.05),TYR处理T4-2细胞逆转其极性后IL-24、CXCL1、CXCL3和CXCL8表达水平也随之下降;应用蟛蜞菊内酯抑制T4-2细胞NF-κB活性,细胞因子IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8的m RNA表达水平分别降低至70%、51%、74%、50%、55%、37%、39%和73%(p0.05);NAC处理3D培养的T4-2细胞,IL-6、IL-24、CXCL1、CXCL2、CXCL3和CXCL8的m RNA表达水平分别降低至19%、27%、15%、35%、18%和14%(p0.05);GO处理3D培养的S1细胞,IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL6和CXCL8 m RNA的表达水平分别升高至6.87倍、7.27倍、3.43倍、4.46倍、2.79倍、4.28倍和14.66倍(p0.05)。(4)ELISA检测结果显示,与极化的S1细胞相比,非极化的T4-2细胞IL-6、CXCL1表达水平分别升高至241倍、4倍(p0.05);NAC处理3D培养的T4-2细胞,IL-6、CXCL1蛋白表达水平分别降低至50%、49%(p0.05)。6.线粒体氧化磷酸化与ROS水平的关系:海马生物能量测定结果显示,与S1细胞相比,T4-2细胞线粒体基础代谢率、ATP转换、极限呼吸率和备用呼吸容量分别上调至1.27倍、1.46倍、1.41倍和1.66倍(p0.05)。q RT-PCR和Western Blot检测结果显示3D培养的T4-2细胞NDUFA11表达水平显著高于S1细胞。结论:1.RAC1是调控ROS产生和细胞极性破坏的关键调节器,即RAC1促进ROS产生进而破坏腺泡极化结构的形成。2.ROS水平升高破坏乳腺癌上皮细胞极性,乳腺腺泡极化结构的破坏直接导致ROS水平升高,ROS水平升高是破坏乳腺腺泡极化结构形成的一个充分必要条件,ROS水平升高引起的细胞极性破坏不依赖于细胞增殖。3.ROS水平升高破坏乳腺上皮细胞极性后促进了NF-κB的激活,NF-κB的激活进而促进大量细胞因子如IL-6、IL-24、IL-32、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6和CXCL8的分泌,细胞因子招募单核细胞、巨噬细胞到达肿瘤部位,促进乳腺癌发展。4.非极化的乳腺癌细胞线粒体NDUFA11表达上调,氧化磷酸化水平升高,是ROS水平升高的一个原因。
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【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.9

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