肝脏巨噬细胞天然免疫膜受体的表达与肝癌的相关性研究

发布时间：2018-02-17 02:54

本文关键词： 肝癌 CD200受体巨噬细胞胶原结构受体共抑制性受体清道夫受体　出处：《中国科学技术大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：肝脏是人体中最大的实体器官。肝脏过滤来源于血液中的有害物质,储存肝糖原作为能源,产生胆汁和消化脂肪,是重要的代谢器官。目前肝脏也被认为是人体中的免疫器官之一,它具有许多独特的免疫学特性,可以执行许多重要的免疫功能。肝脏独特的免疫功能与它的结构是密不可分的。除了局部免疫反应外,肝脏也可以调节全身固有免疫反应,在对抗病原体,寄生虫及恶性肿瘤细胞中起到了重要的作用。肝脏主要由肝细胞组成,同时含有大量的NK细胞,NKT细胞及巨噬细胞。肝脏中含有最大的驻留巨噬细胞群(枯否细胞),占到了人体中所有组织巨噬细胞的80-90%。另外,肝脏中还含有大量浸润单核细胞／巨噬细胞,特别是在肝损伤及感染时可以大幅增加巨噬细胞向肝脏的迁移与定居。成人原发性肝细胞癌(HCC,包括肝癌和胆管癌)是全世界癌症相关死亡的第二大原因。肝癌构成了肝脏中大部分的恶心肿瘤,它一般是由常见的临床风险因素所致,包括慢性乙肝病毒和丙肝病毒感染,大量酒精摄入,脂肪性肝炎,和糖尿病。大多数的肝癌都是由慢性乙肝病毒及丙肝病毒感染所致,慢性病毒感染会发展成为持续性的炎症,导致纤维化／肝硬化伴随着大量的淋巴细胞浸润。肿瘤内不同类型细胞和其基质之间的cross-talk通常会诱导肿瘤的发展。目前,肝癌切除术仍然是治疗肝癌最有效的疗法之一。由于较高的复发率,肝癌患者的整体术后存活率仍然不能令人满意。为了研究巨噬细胞与肝癌发生发展的关系并寻找可能的免疫预测方法,本论文开展了如下研究。Ⅰ. 抑制性受体CD200R的表达与肝癌预后密切相关免疫系统有自己的方法来平衡其免疫反应及免疫耐受。一方面,免疫系统识别并且清除表达外来抗原的肿瘤细胞,而另一方面,它通过免疫耐受机制精细控制对于表达自身抗原的细胞的攻击。同时,肿瘤细胞通过“免疫编辑”并利用免疫系统的免疫耐受机制逃避免疫攻击。免疫逃逸的基本机制已被广泛研究,其中之一是通过操控细胞活化后表达的免疫调控分子。一般认为,在癌症的发展过程中,免疫细胞会被耗尽并且其功能降低,使得肿瘤细胞更容易逃逸免疫应答。免疫细胞的耗尽通常伴随着共抑制分子的高表达,对这些负调分子的操控可以很好的恢复免疫应答,从而起到对抗肿瘤细胞的作用。抑制性CD200:CD200R轴对于早期微生物感染时防止炎症反应和免疫病理至关重要。在几种肿瘤模型中都已经验证了CD200的表达与癌症的发展是密切相关的,且阻断这条通路可以恢复抗肿瘤的免疫应答。CD200广泛表达于多种细胞类型,包括实体瘤和恶性血液瘤,而它的受体CD200R,主要表达在髓系来源和淋巴系来源的免疫细胞上。CD200-CD200R轴似乎有助于肿瘤细胞逃逸以及对免疫应答的抑制。由于CD200-CD200R轴在不同的肿瘤模型中都抑制了免疫应答,并且不同程度直接或者间接的干扰了免疫细胞的活动,我们因此探究了CD200-CD200R轴与肝癌之间的相关性。在我们的研究中我们发现肝癌患者中CD200及CD200R的表达明显高于正常人。我们观察到CD200R主要表达在巨噬细胞上而CD200广泛分布于各种肝细胞及肝癌细胞上。癌周基质(peritumoural stroma)也被称为invasive margin,它连接了肿瘤的中心区域与肿瘤的远端区域。肿瘤中不同类型的细胞与其基质之间的cross-talk现在被公认为肿瘤发展的因素之一。癌周基质有大量的白细胞浸润,因此很容易就可以在显微镜下识别。CD200R主要表达在癌周基质区域,提示了CD200R在抑制这些CD200R+浸润白细胞中的作用。除了免疫组化染色观察,IOD/area的值也用于代表肝癌患者中CD200R的表达量。较高的IOD/area意味着更高的表达,反之亦然。CD200R的IOD/area与肝癌患者的肿瘤直径以及AFP都成正相关,并且晚期肝癌患者及丢失了肿瘤包膜的肝癌患者的癌周基质中的CD200R的表达远远高于早期肝癌患者及肿瘤包膜完整患者,这些都表明了CD200R的表达随着肿瘤的发展而累积,并且可以作为探测肿瘤发展的潜在标志物。虽然癌症患者的免疫抑制状态众所周知,大量的证据表明,在肿瘤局部发生的炎症反应同样可以促进肿瘤的生长和发展。肝癌通常由伴随着广泛白细胞浸润的肝硬化诱导而来。在这些浸润的白细胞当中,巨噬细胞来源的枯否细胞通常集中在癌周基质,而在肿瘤中心只有很少的巨噬细胞存在。通过在连续切片上对CD8,CD57和CD68进行免疫组化染色,我们再次证实了肝癌组织中大量CD68+细胞的存在。此外,大多数CD200R+细胞与CD68+细胞共定位,证实了在这种特殊状态下CD68+巨噬细胞上CD200R的表达。值得注意的是,肝癌与其他恶性肿瘤不同,肝癌的预后不仅仅取决于肿瘤的分期,还取决于伴随着的肝硬化引起的功能障碍。因此,我们进一步研究了CD200R在肝损伤中的作用。CD200R高表达患者和CD200R低表达患者之间AST水平的比较表明CD200R高表达的患者的血液中的AST表达也更高。肝癌患者通常伴有较高的肿瘤复发率和转移率,可以预测肝癌复发和转移的潜在生物标志物的探索显得尤为重要。在我们的研究中,我们发现CD200R高表达患者的总体生存率和无复发生存率都要远远低于CD200R低表达患者,预示了CD200R作为一个可预测肝癌预后复发及生存的指标的可能性。我们的研究结果提示过强的CD200R信号通路可导致免疫耐受以抑制肝癌患者中的免疫功能。同时,也预示阻断这条信号通路可以逆转肿瘤的免疫逃逸以恢复抗肿瘤免疫应答,提示了CD200R在提高免疫治疗功效中潜在的作用。另一方面,CD200R信号通路不仅可以抑制免疫应答,它同时也会抑制促进肿瘤的炎症反应。对CD200-CD200R相互作用的阻断增强了抗肿瘤反应的同时也增强了促进肿瘤的炎症反应,这样的炎症反应最终也将导致肝癌的发展。因此,当用CD200R作为checkpoint来进行阻断的同时其促进炎症的这一方面也不容忽视。我们需要找到其中的平衡才能更好的使用它为临床作出贡献。总而言之,我们首次证明了癌周基质中CD200R的表达可以作为潜在的指标预测肝癌的发展和预后。CD200R高表达患者有可能伴随更为严重的恶性肿瘤,更高的复发率和更低的生存率。因为目前针对肝癌治疗的方法是非常有限的,CD200R可以被认为是一个治疗肝癌的潜在治疗靶点。然而,详细的机制需要进一步的研究,更多更全面的研究才能使我们到达这一目的。Ⅱ. MARCO氐表达与肝癌病程发展及患者生存预后密切相关天然免疫细胞可以通过包括清道夫受体(SR)等一系列的模式识别受体,来对外界抗原及病原体进行免疫识别。巨噬细胞胶原结构受体(MARCO)来自于A类清道夫受体家族,其具体的特征是胞外段存在胶原和富含半胱氨酸的结构域。两种受体均在巨噬细胞和树突状细胞上表达,其功能是在多种细胞上作为分子传感器,同时作为吞噬受体与各种微生物组分进行结合。然而,一些研究线索表明,清道夫受体除了模式识别和吞噬清除的功能外,还存在其他的潜在功能。MARCO表达于非常特定的巨噬细胞亚群,其表达会在机体发生细菌感染后在炎症部位大量提升。这些特性提示我们,MARCO除了模式识别和吞噬清除的功能外,还发挥调节免疫炎症和免疫应答的潜在功能。目前针对MARCO研究还始终缺乏系统深入的工作,尤其是对于在肿瘤的发生发展过程中,MARCO的表达与发挥作用几乎没有相应研究,导致对于此方面的知识还存在空白。我们通过文献调研发现,针对肝癌样品大规模RNA测序和比较肝癌原发病灶组织和癌旁健康组织之间的差异表达基因,MARCO表达存在显著性的差异,是差异表达最显著的前30个基因之一。同时,肝脏富含巨噬细胞,是MARCO表达的主要细胞。这些前人的发现提示我们,MARCO在肝癌微环境中是否发挥着重要的作用?MARCO能否作为肝癌及其相关疾病的预后指标?人类和小鼠的肝脏中均含有丰富的天然免疫淋巴细胞,如NK细胞,NKT细胞和枯否细胞。鉴于现有的证据表明,MARCO在巨噬细胞上高表达,我们进一步检测了MARCO在肝脏中的可能发挥的潜在角色。有趣的是,公开基因表达数据库(Oncomine, www.oncomine.org)中表明,在正常肝组织MARCO的mRNA表达比在HCC显著升高。在我们的研究中发现,通过免疫组化染色检测MARCO在肝癌组织中的表达水平,将IOD/area做为MARCO蛋白表达的量度。较高的IOD/area意味着更高的表达,反之则意味着MARCO表达降低。与基因表达数据库的结果一致,在我们的肝癌组织和癌旁组织样品中,无论是蛋白质水平和mRNA的表达水平,MARCO在肿瘤内组织显著低于癌旁正常组织,提示MARCO在肝癌组织微环境中,发挥着重要作用。此外,我们的研究结果显示,MARCO在健康志愿者的肝脏中的表达水平最高,其次是肝硬化患者,肝癌患者,肝癌转移患者,而这又与基因数据库的结论相统一。我们还进一步发现,在肿瘤周围间质区域和癌组织之间,MARCO表达会形成很明显的一条清晰边界,在癌内MARCO表达明显的低于癌旁的组织。健康对照组的MARCO表达显著性高于肝癌患者和肝癌转移患者,MARCO的表达随着肝癌病情的加重,会在肝脏组织中逐渐降低。通过进一步的分析,我们发现MARCO表达水平不仅会伴随着疾病的进程而越来越低,MARCO的表达与肿瘤的分期进展密切相关。结果发现,处在TNM早期患者的肝脏组织中MARCO表达水平显著高于处在TNM晚期的患者,而且在有明显肿瘤包膜的患者体内MARCO表达也会显著高于没有肿瘤包膜的患者,这两个参数通常都与肿瘤的严重性密切相关。这些数据表明,MARCO表达水平会沿着疾病进程和肿瘤进展,而逐渐减少减低,提示我们在预测肝癌相关疾病的发生发展过程中,MARCO存在作为肿瘤预后标志物的潜能。尽管癌旁组织与癌组织比较,往往会被认为是“相对正常”组织,然而癌旁组织在镜下观察,也会存在不同程度的炎症反应。枯否细胞是肝脏驻留的巨噬细胞,其与肝脏内的炎症反应密切相关。在识别外来抗原方面,枯否细胞可以被活化并释放多种炎症介质,包括多种细胞因子(TNF-α,IL-1β和IL-6),趋化因子(单核细胞趋化蛋白-1,MCP-1),巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α,MIP-1β和RANTES等。我们的结果中通过激光共聚焦检测发现,CD68+巨噬细胞标记和MARCO+标记会共定位在同一细胞上,证实在肝癌组织中MARCO的表达主要是在枯否细胞上表达。肿瘤复发和转移,可以严重影响术后生活质量和术后存活率。在我们的研究中发现,MARCO的表达与患者术后的生存预后密切相关,肝癌组织中高表达MARCO的患者会伴随着更久的生存周期时间,这些结果提示MARCO在HCC患者中具有预测生存预后的价值。终上所述,本研究工作首次阐明了MARCO和肝癌之间的相互关系。尤其是我们的结果表明,患者的肝癌组织内低表达MARCO,会伴随着更差的疾病预后和生存周期下降。在本研究工作中,我们提供了充分的证据表明MARCO在肝癌病人中发挥着重要角色,这些发现之前都没有被研究和报道过。然而,MARCO在肝癌患者中低表达是否是疾病恶化的原因或只是其预后不良的结果仍存在不清楚的地方。一方面,鉴于MARCO主要表达于巨噬细胞,但驻留在肝癌肿瘤组织中的巨噬细胞较少,所以检测到的MARCO表达强度降低可能是由于在肝癌组织中的巨噬细胞表达减少导致。另一方面,MARCO表达水平的变化是否会影响巨噬细胞的表达改变,并且这些肝癌微环境针对MARCO和巨噬细胞的改变,会如何增强肿瘤的进展仍然不明。因此,MARCO-肝癌轴的具体调节机制还有待于进一步的工作证明,以及更大量的临床样品研究来确认MARCO作为肿瘤预后指标的可能性。
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【学位授予单位】：中国科学技术大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【参考文献】