胶质瘤缺氧转录与代谢表征的生物意义和肺癌IF1表达的临床意义

发布时间：2018-02-19 19:41

本文关键词： 胶质瘤转录组代谢组缺氧 IF1 非小细胞肺癌淋巴结转移预后　出处：《第三军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分:缺氧对胶质瘤细胞基因表达和物质代谢的影响及其生物学意义目的:胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤,其中恶性胶质瘤具有生存期短、易复发及难治疗的特点。尽管近年来有大量的研究,从细胞、动物实验及临床水平探讨揭示了恶性胶质瘤发生发展的分子机制,并从手术、放疗、化疗、基因、靶向、免疫等方面深入探讨了恶性胶质瘤的综合治疗方法。但是目前恶性胶质瘤患者术后平均生存期仍然不到1年,且大部分胶质瘤表现出对放化疗极强的耐受性。其关键在于目前尚缺乏可用于恶性胶质瘤早期诊断的特异性标志物,以及可指导临床进行靶向治疗的特异性干预靶点。因此,积极研究寻找恶性胶质瘤的特异性标志物和特异性干预靶点对提高治疗质量具有重要的理论意义和巨大的临床应用价值。近年来,高通量测序技术和代谢物检测分析技术的快速发展,为从基因及代谢产物等分子水平揭示恶性肿瘤的发生发展机制、寻找特异性生物标志物及特异性干预靶点提供了新的技术手段和实现路径,因而在恶性肿瘤的研究中得以广泛应用。恶性胶质瘤细胞的无限增殖、侵袭、耐药以及高复发等特性除了与胶质瘤细胞自身的特性有关外,还与其以缺氧为特征的肿瘤微环境密切相关。但是,迄今为止,有关缺氧在胶质瘤细胞基因转录和物质代谢改变过程中的作用及其生物学意义尚不十分清楚。因此,本研究采用转录组学、代谢组学等技术方法系统研究了常氧及缺氧条件下恶性胶质瘤细胞基因转录和代谢物改变的表征,采用生物信息学方法分析揭示了恶性胶质瘤细胞中活化的生物过程和信号通路及其关键分子,并结合CCLE数据库及恶性胶质瘤患者的组织和血液样本对其进行了验证,不仅为深入揭示恶性胶质瘤的发生发展机制提供了新的视角,而且为寻找恶性胶质瘤生物标志物及特异性治疗靶点提供了实验依据,最终为恶性胶质瘤患者的个性化治疗提供了可能,对提高恶性胶质瘤的治疗水平具有重要的理论意义和潜在应用价值。方法:1.转录组学生物信息分析以正常星形胶质细胞HEB和恶性胶质瘤细胞U87-MG作为模型,于21%和1%O2环境培养24h收集细胞总RNA行RNA-Seq检测。转录组数据经原始测序数据质量评估及比对到人类参考基因组(hg19)后,采用R软件包Nioseq计算差异表达基因,选取差异倍数≥2及偏离概率值≥0.8为显著性阈值,筛选差异表达基因。根据上调差异基因在U87-MG细胞中的表达量值FPKM,选取FPKM≥1000、10≤FPKM1000及FPKM10为阈值将上调差异基因分为高表达、中度表达和低表达三类,以高表达组作为U87-MG细胞的特征性表达基因,结合蛋白互作数据库Int Act、MINT、Matrix DB、DIP、I2D和Innate DB分析U87-MG细胞的生物学功能。使用Enrichr及REVIGO在线分析工具对差异表达基因进行GO功能注释和KEGG通路分析。随后使用CCLE数据库对筛选出的U87-MG细胞核心通路及特征表达基因进行进一步验证。以HEB细胞对缺氧环境的应答过程作为背景,结合CCLE数据库中恶性胶质瘤各细胞系表达谱筛选在U87-MG细胞中持续表达的缺氧敏感性基因,并使用蛋白印迹在细胞中对STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表达进行检测。2.GBM患者血液及组织标本验证关键分子收集GBM病人血液及组织标本,离心后获取血浆样品,使用ELISA法对GBM病人血浆标本中炎症相关分子IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表达量进行检测,采用免疫组化技术在GBM患者中对缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1的蛋白表达及分布进行检测。3.代谢组学分析以HEB和U87-MG细胞系作为模型,分别于21%和1%O2环境培养24h收集细胞行代谢组学检测。样本在质量控制的基础上,行液相色谱-质谱分析得到色谱数据。通过R软件提取色谱峰,进一步进行内参标准化和细胞数校准后。之后我们通过数据多变量统计分析(SIMCA-P12.0)和单变量统计分析(SPSS19.0),得到常氧U87-MG相较于HEB细胞以及缺氧环境下U87-MG和HEB细胞相较于其自身常氧的差异代谢物。通过在HMDB和METLIN数据库进行验证后,使用Metabo Analyst 3.0进行通路富集分析,结合KEGG数据库,绘制代谢通路示意图。进一步结合分析转录组中代谢酶的变化,探讨胶质瘤的代谢表征和缺氧后的物质代谢变化。结果:1.与HEB细胞相比,在U87-MG细胞中共有5215个差异表达基因,其中上调基因2759个,下调基因2456个。上调基因主要富集在炎症反应、血管生成及细胞运动等生物学过程,其中炎症反应主要活化的通路为细胞因子间相互作用及Toll样受体通路。2.U87-MG细胞差异上调基因中,筛选到特征表达基因12个,且其参与的通路均与炎症反应、血管生成及细胞运动相关。其中恶性胶质瘤患者IL1B、CSF3和TIMP1蛋白表达量显著高于健康体检者。3.U87-MG细胞缺氧过程中,细胞分裂、DNA复制、三羧酸循环、线粒体转运及ATP代谢过程受到抑制,而细胞内稳态调节及脂质的细胞应答过程被激活。4.缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1在U87-MG细胞中持续性高表达,且恶性胶质瘤患者脑组织中其蛋白表达显著高于正常脑组织。5.U87-MG细胞与HEB细胞差异代谢物共119个,其中表达上调59个,下调60个,主要富集于三羧酸循环、脂质代谢、糖酵解、氨基酸及核酸代谢通路等代谢过程。与正常细胞HEB相比,胶质瘤细胞U87-MG糖酵解增强,氨基酸和脂代谢增强,但有氧氧化和核酸代谢减弱。6.1%O2环境处理U87-MG细胞时,氨基酸代谢和糖代谢的增强更为显著。而1%O2环境处理HEB细胞时,脂肪酸合成和代谢则更为旺盛。结论:HEB和U87-MG细胞之间基因表达差异显著,U87-MG细胞中炎症反应、血管生成及细胞运动等生物学过程明显活化。炎症相关的Toll样受体通路及细胞因子间相互作用信号通路在U87-MG细胞呈现高度活跃状态。HEB和U87-MG细胞对缺氧刺激的应答模式明显不同,U87-MG细胞中,细胞分裂、DNA复制、三羧酸循环、线粒体转运及ATP代谢过程受到抑制,而细胞内稳态调节及脂质的细胞应答过程被激活。同时炎症相关因子IL1B、CSF3和TIMP1及缺氧敏感基因STC1、HMOX1和TGFB1有望成为GBM患者临床早期诊断及组织病理诊断和预后评估的生物标志物。同时在代谢产物上,与HEB细胞相比U87-MG细胞糖酵解增强,氨基酸和脂代谢增强,但有氧氧化和核酸代谢减弱,而在缺氧时,氨基酸代谢和糖代谢的增强更为显著。第二部分:IF1在非小细胞肺癌中的表达及其临床意义目的:肺癌是当前世界上发病率最高的恶性肿瘤,其中非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)在总的肺癌病人中占比高达85%。虽然目前NSCLC的手术治疗、放疗、化疗以及基因治疗方法已有较大进步,但治疗效果仍然十分有限,总的治愈率在10%左右。其中主要原因是NSCLC的生物学特性复杂,恶性程度高,80%的肺癌患者在首次就诊时已是晚期,因此,寻找新的肿瘤标志物是未来肺癌治疗的突破口之一。ATP合酶抑制因子1(ATPase inhibitory factor 1,IF1)在多种肿瘤中高表达,并且参与了肿瘤的代谢重编程。我们推测IF1可能作为NSCLC的潜在生物标志物。方法:对149例NSCLC标本进行IF1免疫组化染色评分。根据评分结果结合病人信息进行分析比较,统计分析IF1的表达与NSCLC患者临床病理参数之间的联系,以及与患者预后和复发的关联。结果:1.IF1在NSCLC中的表达均显著高于正常组织(p=0.034),晚期患者(TNM III/IV)的IF1表达水平显著高于早期患者(TNM I/II)(p=0.033)。2.在NSCLC组织中,IF1的表达与患者的TNM分期(p=0.032)、淋巴结转移与否(p=0.043)、吸烟与否(p=0.017)相关。TNM分期越晚,有淋巴结转移,吸烟患者的IF1表达水平越高。3.IF1高表达的NSCLC患者的生存时间明显短于IF1低表达的NSCLC患者(p=0.007),且IF1的高表达与否可以作为NSCLC组患者独立的预后指标之一(HR=1.667,p=0.034)。在早期患者(TNM I/II)中IF1高表达的NSCLC患者的生存时间明显短于IF1低表达的非小细胞肺癌患者(p=0.042),4.IF1高表达的NSCLC患者的复发率明显高于IF1低表达的NSCLC患者(p=0.003)。结论:IF1在NSCLC组织中的表达显著高于正常肺组织,并且与TNM分期和淋巴结转移呈正相关。IF1可作为NSCLC患者独立的预后和复发指标。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第三军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R739.41

【相似文献】