γ-H2AX在肝细胞肝癌中的表达及作用机制的研究

发布时间：2018-02-19 22:22

  本文关键词： 肝细胞肝癌 肝移植 组蛋白H2AX 磷酸化组蛋白H2AX 缺氧　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：背景：在我国,原发性肝癌,简称肝癌是第二位癌症杀手；由于我国是乙型病毒肝炎大国,全球每年78万新发肝癌病例中约50%以上发生在我国。经过长期的努力,我国肝癌基础研究与临床治疗都取得了显著进展。然而,肝癌根治切除术后5年复发率高达60%,并且肝癌肝移植术后肿瘤复发也是影响受者存活的主要因素。由于肝癌组织有处于缺氧环境的特点,导致肝癌细胞在面对缺氧条件时,会诱发肝癌组织新生血管形成,肿瘤转移等促进肿瘤存活的反应,从而使肝癌的恶性行为提高,降低肝癌患者预后。因此,探讨缺氧条件下,肝癌复发转移的分子机制,寻找肝癌复发转移的标志物和有效的干预靶点,是早期诊断,早期治疗,并进一步提高病人生存的关键。目的：本研究利用mRNA表达谱基因芯片筛选缺氧条件下肝癌细胞株与未缺氧肝癌细胞株间差异表达的mRNA,通过生物信息学分析寻找出与肝癌缺氧以及与肝癌发生发展相关的潜在标志物。对挑选出的潜在分子标记物H2AX及其磷酸化产物gammaH2AFX(γ-H2AX)首先在肝癌肝切病人以及肝癌肝移植病人肝癌组织和配对癌旁组织进行表达验证,然后分析其与移植病人临床病例资料以及肝移植术后病人预后的关系。最后通过各类分子生物学技术,进一步明确H2AX在肝癌细胞株中的肿瘤学功能,探究其在肝癌发生发展的分子机制。方法：1.利用mRNA表达谱基因芯片技术(Affymetrix Human U133 plus 2.0 array)筛选不同时间点(2小时,8小时,24小时)缺氧条件下肝癌细胞株与未缺氧肝癌细胞株间差异表达的mRNA,并鉴定。2.收集32对HCC患者肝癌肝切病人肿瘤及配对癌旁冰冻组织,以及57例肝癌肝移植病人肿瘤组织,37例癌旁组织及17例正常肝脏组织石蜡标本,利用实时荧光定量PCR、免疫组化技术验证差异表达蛋白组蛋白H2AX (H2A histone family member X)及其H2AX的S139位的磷酸化形成γ-H2AX在各类组织中的表达情况。3.根据免疫组化结果分析γ-H2AX与肝癌肝移植病人临床病例资料以及移植术后病人总体及无瘤生存率的关系。4.通过构建干扰H2AX稳转Bel-7402和HepG2肝癌细胞株的方式,从而建立γ-H2AX低表达的肝癌细胞株,利用Cell Counting Kit-8 (CCK-8), Transwell细胞侵袭转移实验,体外血管形成实验检测H2AX在调控肝癌细胞增殖,侵袭转移能力,以及血管形成中的作用。通过裸鼠皮下成瘤实验观察H2AX对肝癌细胞体内成瘤形成能力的影响,裸鼠尾静脉肺转移模型观察H2AX肝癌细胞体内肺转移的能力。5.利用蛋白芯片预测H2AX调控的下游蛋白。并利用Western blot,荧光共聚焦,免疫共沉淀技术探索H2AX缺氧条件下磷酸化γ-H2AX形成对肝癌发生发展的分子调控机制。结果：1.本实验中mRNA表达谱基因芯片分析发现H2AX随着缺氧时间的延长,肝癌细胞株的表达不断降低。(倍数改变≥2.0倍,p0.05)。通过实时荧光定量PCR进行验证,结果与芯片一致。2.实时荧光定量PCR结果表明H2AX mRNA水平在32对肝癌组织中表达与配对癌旁组织无统计学意义(p=0.3878)。免疫组化结果分析提示H2AX磷酸化形成的γ-H2AX表达在肝癌组织,癌旁组织,正常肝中表达逐渐降低。3.根据免疫组化结果,将γ-H2AX分为高低表达两组。临床资料统计分析发现γ-H2AX蛋白表达水平与肝癌肝移植患者肿瘤大小(p=0.022)、血管侵袭(p=0.005),TNM分期(p0.001)密切相关,与患者性别、肿瘤数目、甲胎蛋白(AFPA)水平等无关。Kaplan-Mier法分析发现γ-H2AX高表达患者总体生存率与无瘤生存率明显低于γ-H2AX低表达组。4.细胞功能学实验表明干扰H2AX表达后,肝癌细胞的增殖能力、侵袭能力以及体外血管形成降低,并且能够减弱肝癌细胞的表皮-间质转化(EMT)能力。裸鼠皮下成瘤实验表明,干扰H2AX能够明显减弱肝癌细胞的体内成瘤能力,并且瘤体内的血管也明显减少,裸鼠尾静脉肺转移模型实验表明,干扰H2AX能够有效减弱肝癌细胞体内肺转移的能力。5.蛋白芯片结果显示,H2AX能够有效调节血管内皮生长因子(VEGF)的表达。缺氧条件下进一步的分子机制探索证明H2AX是表皮生长因子受体(EGFR)及缺氧诱导因子(HIF-1α)的上游基因,缺氧条件下,HIF-1α的异常升高可能由于H2AX磷酸化形成的γ-H2AX异常升高导致。而γ-H2AX升高能够通过促进EGFR向细胞核内转移而激活HIF-1α蛋白,HIF-1α蛋白的活化则促进VEGF的表达。因此我们在肝癌中发现了γ-H2 AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信号通路,这条通路促进了肝癌在缺氧条件下的血管形成和远处转移能力。结论：1.肝癌肝移植患者γ-H2AX高表达者,其总体存活与无瘤存活率要明显差于γ-H2AX低表达患者。γ-H2AX可能是肝癌肝移植术后肿瘤复发预测的潜在分子标志物；2.肝癌发生发展过程中存在γ-H2AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信号通路,促进了肝癌在缺氧条件下的血管形成和远处转移能力。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

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本文编号：1518127