CHN1通过促进细胞侵袭迁移参与宫颈癌和先兆子痫疾病发生的作用及相关调控机制研究

发布时间：2018-02-20 02:10

  本文关键词： 宫颈癌 CHN1 上皮间质转化 Akt/GSK-3β信号通路 先兆子痫 微小RNA CHN1 胎盘　出处：《北京协和医学院》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分CHN1在宫颈癌中的表达与机制的研究背景:宫颈癌是全球第二大妇科恶性肿瘤,同时也是中国致死率排名第八的癌症,宫颈癌的浸润和转移是导致患者死亡最重要的原因。上皮间质转化(Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT)是当前用以解释实体肿瘤转移机制的一大学说,EMT和其调节因子在肿瘤的生长、凋亡抵抗、转移等方面产生一定的作用。α-嵌合蛋白(α-chimaerin,CHN1)是一种ras相关蛋白,在信号信息调控和发育中发挥着重要的作用。本课题就CHN1在宫颈癌发生发展中的机制展开研究,初步探讨了 CHN1、EMT以及相关信号通路的作用关系以及所涉及的调控机制。目的:探讨CHN1的表达与宫颈癌临床病理学的关系,明确CHN1的差异表达对肿瘤在体外、体内环境中生物学行为的影响,探索CHN1参与肿瘤信号通路的分子机制。方法:为验证临床样本中CHN1与肿瘤之间的关系,首先,使用免疫组织化学技术对宫颈癌及其配对的癌旁组织中CHN1的表达进行检测,并同时对病理类型和相关参数进行分析,明确CHN1作为肿瘤标志物的临床意义。然后,在宫颈癌细胞系中分别转染shRNA干扰质粒和全长cDNA克隆表达质粒,经筛选获得稳转细胞株,建立CHN1干扰和高表达的宫颈癌细胞株,并同时对构建成功的细胞进行增殖、侵袭和迁移能力的检测。第三,分别从mRNA水平和蛋白水平对CHN1差异表达细胞株中EMT标志物的表达进行检测。第四,利用裸鼠移植瘤实验检测CHN1的表达对裸鼠致瘤性的影响,并用免疫组化的方法对CHN1相关蛋白的表达进行检测;最后,利用Western Blotting和免疫荧光技术明确CHN1可能参与的肿瘤信号转导通路的分子机制。结果:免疫组织化学结果显示,CHN1表达于宫颈癌组织,主要定位于癌组织的胞浆区域;与宫颈癌癌旁组织相比,CHN1在癌组织中的阳性率为85.5%,在癌旁组织中的阳性率为43.4%,差异具有统计学意义(P0.01)。CHN1的表达情况与肿瘤淋巴结转移有关(P0.05),与宫颈鳞癌患者的年龄、肿瘤病理分期、分化程度无关(P0.05)。生存曲线单因素分析显示,CHN1表达强阳性/阳性的宫颈癌患者,其生存时间低于CHN1阴性的患者,差异具有统计学意义(P0.05)。体外CCK-8实验结果显示,高表达CHN1时,细胞增殖速度明显加快,而CHN1的表达被干扰后,细胞的增殖能力明显减弱,差异具有统计学意义(P0.01);克隆形成结果显示,高表达CHN1时,细胞克隆形成能力显著提高,而干扰CHN1表达时,宫颈癌细胞的克隆形成能力明显减弱,差异具有统计学意义(P0.01)。侵袭和迁移实验结果显示,当干扰宫颈癌SiHa细胞CHN1表达时,宫颈癌细胞的侵袭和迁移能力受到明显的抑制作用,差异具有统计学意义(P0.01)。在裸鼠成瘤实验中,利用CHN1高表达细胞株和CHN1干扰细胞株成功构建了裸鼠移植瘤,经HE检测其为肿瘤,且CHN1高表达细胞株所形成的肿瘤体积更大,经免疫组化验证,该肿瘤中CHN1的表达量更高。Western Blotting结果显示,高表达CHN1可以诱导宫颈癌细胞发生EMT,同时伴随上皮来源标志物表达的降低,以及间质来源标志物表达的提高,并诱导EMT相关转录因子的表达。在宫颈癌细胞系中,高表达CHN1可以激活Akt/GSK-3β信号通路,而使用该信号通路特异性抑制剂LY294002时,该通路的活化受到抑制。结论:在宫颈癌中CHN1的高表达与宫颈癌的远期预后不良相关。CHN1能够在细胞水平促进肿瘤生物学行为的发生。CHN1可以通过对Akt/GSK-3β对EMT产生激活作用,并通过EMT促进宫颈癌的转移。第二部分 miR-205/CHN1在先兆子痫胎盘中的表达与作用机制研究背景:先兆子痫(Preeclampsia,PE)是一种妊娠20周后出现的特发性高血压综合征,是导致孕妇前出血、流产、早产以及胎儿和孕产妇死亡的主要原因之一。微小RNA(microRNAs,miRNAs)是一类内源性非编码小RNA,miRNAs可以通过基因转录后调节机制参与调控细胞的增殖、周期调控、细胞分化及凋亡等一系列过程。microRNA-205(miR-205)是新近发现高表达于先兆子痫患者胎盘和血浆中的miRNA,其参与调节先兆子痫的具体机制尚不清楚。在本研究中,我们证实miR-205可以靶向调控CHN1的表达,而在第一部分的研究中CHN1已被证明可以调控细胞的侵袭迁移,所以,我们着重在临床胎盘样本和细胞系中对miR-205及其靶基因的表达以及二者间的直接靶向调控关系进行了检测,初步对miR-205靶向CHN1调节绒毛滋养层细胞的生物学功能的影响进行了探索。目的:在临床样本和绒毛滋养层细胞水平上研究miR-205对先兆子痫的具体作用机制,以及miR-205对CHN1的靶向调控作用。探索miR-205/CHN1对滋养层细胞功能的影响,以及参与调节先兆子痫发生的具体机制。方法:利用real-time PCR技术以及免疫组织化学手段检测miR-205以及CHN1在先兆子痫样本中的表达情况;生物信息学预测miR-205与CHN1的可能结合位点;构建双荧光素酶报告载体,利用双荧光素酶报告系统检测miR-205对其靶基因CHN1-3'UTR区域的靶向结合作用;real-time PCR和Western Blotting方法进一步验证miR-205与CHN1之间的直接靶向作用;利用CCK-8、transwell、划痕实验研究miR-205以及miR-205与其靶基因的相互作用对绒毛滋养层细胞生物学功能的影响。结果:real-time PCR检测miR-205和CHN1在正常胎盘和先兆子痫临床标本中的表达,结果表明miR-205在先兆子痫样本中的表达量显著高于正常对照组,而CHN1在先兆子痫患者组中的相对表达量则明显低于正常对照组,结果均有统计学意义(P0.05);先兆子痫患者和正常产妇胎盘石蜡切片的免疫组织化学染色结果显示,CHN1在先兆子痫患者的胎盘中低表达。根据生物信息学的预测,CHN1-3'UTR区域有两个miR-205的保守性结合位点,利用pmirGLO-Vector成功构建CHN1-3'UTR的野生型和突变型载体后,双荧光素酶报告系统检测miR-205和CHN1的直接靶向结合情况,结果显示,miR-205仅和CHN1的第一个结合位点具有靶向结合效应。real-time PCR对使用模拟物和抑制物处理后的滋养层细胞中CHN1的表达检测结果显示,miR-205对CHN1的表达具有负调控的作用;Western Blotting检测同样证实,当高表达miR-205时,CHN1的表达明显下调。体外增殖实验结果表明,绒毛滋养层细胞高表达miR-205时,细胞的增殖能力显著减弱;侵袭、迁移实验结果证实,miR-205高表达的绒毛滋养层细胞具有相对减弱的侵袭、迁移能力,而同时转染CHN1可以逆转侵袭能力减弱这一结果。结论:与正常组相比,miR-205在先兆子痫患者的胎盘组织中高表达。miR-205和CHN1-3'UTR区域结合,对CHN1在mRNA和蛋白水平上的表达具有靶向调节作用。miR-205可以调控CHN1对滋养层细胞的侵袭、迁移能力产生影响。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R737.33;R714.244

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本文编号：1518515