类载脂蛋白C-I在乳腺癌血清中的鉴定及生物学特性研究

发布时间：2018-02-20 02:40

本文关键词： 乳腺癌蛋白质组学类载脂蛋白C-I　出处：《郑州大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景乳腺癌是全球范围内女性最常见的恶性肿瘤,在过去的10年间,乳腺癌在全世界范围内的发病率逐步上升,虽然大部分为绝经后患者,但仍有15%-26%的患者为绝经前患者,其中40岁以下的患者大约占7%。中国乳腺癌人群的发病年龄与欧美国家不同,相当数量的绝经前女性被诊断出乳腺癌,这类人群往往在生活角色和社会角色的扮演上更为重要,因此早期发现以争取获得治愈的机会对患者来说尤为重要。如果可以找到敏感性高、特异性高并且可以用于早期诊断和筛查的生物指标,就能够早期发现尚处于亚临床阶段的病变。蛋白质血清标记物在乳腺癌诊疗中有一定的参考价值,因其创伤性小、敏感度高在乳腺癌早期诊断领域有着更广阔的发展空间。相比于基因,蛋白质是复杂生命现象及病理状态的真实体现者,更能直接地反映机体生理及病理过程的变化。不仅可以反映蛋白质水平的变化,而且可以反映蛋白质翻译和修饰后水平的变化,其敏感性和准确性都相对较高,而且随着蛋白质组学技术的不断完善和发展,通过检测血清中的差异蛋白质来发现新的乳腺癌生物标记物逐步成为一种成熟的技术。SELDI-TOF-MS蛋白芯片技术就是对肿瘤患者和健康对照人群的血清或组织标本进行差异蛋白质谱的比较,找出该肿瘤特异的蛋白质,可以早期和动态地检测疾病的发生发展,更加敏感、精确、有效。本研究按上述思路,通过收集乳腺癌患者和正常健康女性的血清标本,应用表面增强激光解析离子化飞行时间质谱(seldi-tof-ms)技术,分别研究了乳腺癌术前组与健康人群组、乳腺癌术前组与术后组、非三阴性乳腺癌组与三阴性乳腺癌组的血清样本,找出各组蛋白质谱的变化特征,进而探求肿瘤特异性血清蛋白质标记物,为乳腺癌的早期诊断、不同亚型的治疗策略及预后分析提供相应的帮助。然后联合maldi-tof-ms、tricine-sds-page和westernblot等多种蛋白质组学技术对筛选出的目标蛋白质进行相关鉴定和验证,再进行乳腺癌细胞株的体外实验研究,观察其对荷瘤小鼠瘤体生长的影响,然后进一步对比实验组和对照组样本免疫组化结果,了解该目标蛋白质肽段的生物学功能,观察其对乳腺癌的影响。研究目的应用seldi-tof-ms技术对比乳腺癌术前组与健康人群对照组、乳腺癌术前组与术后组、三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组之间的血清蛋白质谱变化特征,筛选出差异性蛋白质峰,建立与乳腺癌早期诊断、病理分型、分子分型、疗效评价、预后评估直接相关的蛋白质指纹图谱模型。并对筛选鉴定出的目标蛋白进行乳腺癌细胞株和动物学实验,进一步了解其生物学特性,探索其在乳腺癌治疗中的作用,为临床上乳腺癌的早期发现、治疗、及寻找新药靶点提供可行的方法。材料与方法1材料血清样本收集与处理,收集郑州大学第一附属医院女性乳腺癌患者资料总计60例,时间自2011年6月至2014年6月,其年龄范围为23-70岁,平均年龄为46.7+0.4岁,病理诊断确诊为乳腺癌,所有患者入组前均未接受任何治疗,诊断明确后接受规范化手术治疗,术后接受化疗、放疗、靶向治疗及内分泌治疗等。其中确诊为三阴性乳腺癌的病例数为22例。同时收集健康女性的血清样本20例,作为健康对照组。所有参与实验的患者及健康对照者,都已了解相关内容,并征得知情同意。连续收集入组乳腺癌术前、对应术后2周的标本,两组均为60例、60例。所有患者均在清晨06:30~07:30抽血留取血清标本,均为空腹,室温下放置时间为0.5-1h,然后将标本放入离心机离心20-30min,参数设置为3000r/min,离心后标本抽取上清液,放至ep管,分别编号标记,放入-80℃冰箱保存待用。2主要试剂与仪器seldi-tof-ms、96孔蛋白芯片(bioprocessor)、seldi芯片、wcx芯片、chaps(3-环乙胺-1-丙磺酸)、乙腈(acetonitrile),dtt(1,4-二硫代苏糖醇)、temed(四甲基乙二胺)均购于美国ciphergen公司,maldi-tof-ms购于英国kratosanalytical公司,真空冷却离心浓缩系统(spdspeedvac)购于美国thermoelectroninc公司,胰蛋白酶(trypsase)于美国promegainc公司。类载脂蛋白c-i肽段由中国泽溪源生物科技有限公司合成。3方法3.1乳腺癌血清中特异性蛋白质的筛选将预先收集并标记好的血清标本解冻,用弱阳离子(wcx)磁珠处理样本,并向处理好的样品中添加基质,将制备好的样本分别点在蛋白质芯片板上,然后对读片操作程序进行编辑,设置参数如下:分子量范围2000da-20000da,最高分子量30000da,并检测仪器的运行情况及其灵敏度,然后把装有检测样本的蛋白质芯片板放置于质谱仪中,通过seldi-tof-ms系统,进行数据收集,并应用相应软件对数据进行处理,分别获取到样本的m/z峰(质/荷比),数据中差异性0.3%的被认为是同一种蛋白质。然后对收集到的样本结果,进行wilcoxon秩和检验,观察两组数据的p值,p值越小,其代表两组之间的差异强度就越大,也越有研究意义,从而筛选出差异明显的蛋白质。3.2乳腺癌血清中特异性蛋白质的鉴定与验证对样本进行筛选后,开始制备凝胶,收集乳腺癌组样品血清2ml,然后加入超纯水,稀释至5ml,再进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(tricine-sds-page)分离,分离结束后进行切胶操作,然后把得到样本分装至不同的ep管中并标记,参照胶内酶解试剂盒的说明书,经酶解得到目标蛋白。向样本中加入提取液,然后对上清液进行提取,将基质添加至上清液后,在蛋白质芯片板上进行点样,然后放入maldi-tof-ms中,经过激光轰击,肽段序列进行收集,然后利用mascot软件,继而与swissprot数据库连接、进行匹配和比对,最终得到目标蛋白质。进而用westernblot对目标蛋白质进行验证。3.3类载脂蛋白c-i肽段对乳腺癌细胞株体内外影响及生物学特性研究根据目标蛋白的氨基酸序列合成肽段,研究肽段对乳腺癌细胞株的影响及对乳腺癌细胞株荷瘤小鼠瘤体的影响,同时对瘤体进行免疫组化检测,进一步了解这一目标蛋白在乳腺癌中的生物学特性及临床意义。结果1乳腺癌差异性蛋白峰的检测1.1乳腺癌术前组与健康对照组之间的比较将两组数据进行预处理,包括对数据去噪、进行基线减除和聚类分析,然后经标准化处理,得到各自的蛋白质峰值,通过wilcoxon秩和检验的方法,共发现到14个差异蛋白峰(p0.01)。其中有11个在乳腺癌组呈高表达,3个在乳腺癌组呈低表达。运用svm回归方法,对样本中youden指数最高的模型进行筛选,最终得到m/z峰位于6447.9的蛋白质肽段。其在乳腺癌组低表达强度为38.0187±34.2194,而在健康对照组呈高表达,表达强度为337.5261±207.6438,差异有显著的统计学意义(p0.01)。1.2乳腺癌术前组与术后组之间的比较对乳腺癌术前组与术后组进行分析,共发现6个差异性蛋白质峰值(p0.01),其中有4个在乳腺癌术前组高呈表达,有2个低表达。使用svm回归方法,从样本中筛选出youden指数最高的模型,最终也得到m/z峰位于6447.9的蛋白标记物,其在术前组表达强度为38.0187±34.2194,术后组表达强度为294.1245±102.8634,差异具有统计学意义(p0.01)。1.3三阴性乳腺癌组与非三阴性乳腺癌组之间的比较对三阴性乳腺组与非三阴性乳腺癌组进行分析比较,从而筛选差异性的蛋白质峰值(p0.01),共筛选出9个,其中有4个在三阴性乳腺癌组低表达,5个呈高表达。使用svm回归方法,从样本中挑选出youden指数最高的模型,也可以得到m/z峰位于6447.9的蛋白标记物,其中在三阴性乳腺癌中表达强度为5.1351+3.6437,非三阴性乳腺癌组表达强度43.6162±18.8542,有统计学意义(p0.01)。2目标蛋白质的鉴定与验证对筛选出的蛋白质肽段进行分离、纯化,使用maldi-tof-ms技术对前期所得到的肽段进行鉴定,结果显示:m/z峰位于6447.9的蛋白质经过鉴定为类载脂蛋白c-i(apoc-i)。然后使用westernblot的方法对鉴定出的目标蛋白质进行验证。3类载脂蛋白c-i肽段对乳腺癌细胞株体内外影响及生物学特性研究3.1类apoc-i肽段对乳腺癌细胞株有杀伤作用随着肽段浓度的升高,24h、48h、72h、96h、120h后肽段对乳腺癌细胞株mcf-7、mda-mb-231杀伤作用逐渐增强。3.2类apoc-i肽段对乳腺癌荷瘤小鼠瘤体生长具有抑制作用对裸鼠接种mcf-7肿瘤细胞成功后分为对照组(生理盐水),实验组(肽段),连续尾静脉给药,给药组裸鼠瘤体生长速度慢于对照组,瘤体的体积大小和重量也具有差异性,同时裸鼠生命体征平稳,未出现死亡等不良反应,可见肽段毒副作用小,并且效果显著。3.3对照组和实验组瘤体免疫组化结果对照组中pcna,ki67,bcl-2表达量明显增高,bax表达量降低,实验组中pcna,ki67,bcl-2表达量明显降低,bax表达量上调,同时可见肿瘤坏死区。结论通过本研究证实了质荷比(m/z)为6447.9的蛋白质为类载脂蛋白c-i(ApoC-I),这种蛋白质肽段在乳腺癌术前组和对照组、乳腺癌术前组和术后组、三阴性组和非三阴性组的血清样本中表达量均有差异,可做为乳腺癌特异性血清蛋白标记物,与临床常用的乳腺癌肿瘤标记物如CA-153和CEA联合用于提高对乳腺癌早期诊断、手术疗效评估。我们的研究还发现类ApoC-I肽段对乳腺癌细胞株具有杀伤作用,是一种新型的蛋白类抗肿瘤药,可能成为乳腺癌治疗的新型靶向药物,也可能在其他类型的肿瘤中发挥作用。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.9

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