miR-214及CREB1在胃癌发生发展和转移中的作用及分子机制研究

发布时间：2018-02-23 00:14

本文关键词： 胃癌转移 miR-214 CREB1 CSF1　出处：《山东大学》2017年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：胃癌是我国及世界上最常见的恶性肿瘤之一,胃癌患者的预后较差。浸润转移是胃癌的一个重要特征,常导致患者预后不良。揭示胃癌浸润转移的分子机制是胃癌基础和临床研究的重要课题。除了基因学的改变以外,非编码RNA特别是microRNA(miRNA,miR),对肿瘤的发生发展、浸润转移也发挥着重要的调控作用。miRNA是一类内生性的、长度约19-25个核苷酸的小RNA,主要是通过与靶基因mRNA的3'非翻译区(3'-UTR)结合,降解靶mRNA或抑制靶蛋白的翻译,广泛参与增殖、凋亡、发育、分化等多种生物学过程,在人类疾病包括肿瘤的发生发展中发挥着重要作用。而目前尚未见miR-214在胃癌中的详细研究。本研究拟在人胃癌组织及细胞系中检测miR-214的表达情况,进行miR-214功能学实验以探究其生物学作用,并鉴定其调控的靶基因。预测软件提示cAMP responsive element binding protein 1(CREB1,cAMP 反应元件结合蛋白)可能是miR-214的一个靶基因,本课题拟初步探究CREB1在胃癌中的表达、功能及分子机制,以期为胃癌的诊断和治疗提供新的方法和靶点。第一部分胃癌中miR-214表达的临床意义及其对胃癌细胞生物学行为的影响研究目的:1.检测miR-214在胃癌组织及细胞中的表达情况。2.分析miR-214与临床病理参数及患者预后的关系。3.探究miR-214对胃癌细胞浸润转移及增殖、凋亡的影响。4.鉴定miR-214直接调控的靶基因。研究方法:1.使用实时定量PCR检测80例胃癌组织和18例非肿瘤胃黏膜组织及4种胃癌细胞株(MKN28、BGC823、MKN45及SGC7901)、1种非肿瘤的永生化细胞株GES-1中miR-214的表达情况。2.收集患者临床资料及随访信息,分析miR-214与肿瘤直径、淋巴结转移等临床病理参数的关系。Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析miR-214的预后价值。3.胃癌细胞转染LV3-hsa-miR-214(过表达)、miR-214 inhibitor(抑制剂)及Negativecontrol(阴性对照)后,进行细胞迁移浸润和增殖、凋亡实验来验证其生物学功能。4.使用TargetScan软件预测miR-214的靶基因,通过荧光素酶检测和Western blot实验,验证miR-214调控的直接靶基因。结果:1.80例胃癌组织中miR-214的表达水平较18例非肿瘤胃黏膜组织下调约6倍,在有淋巴结转移的胃癌组织中下调更明显。同时,4种胃癌细胞中miR-214的表达水平较非肿瘤胃粘膜组织也呈现不同程度的下调。2.miR-214的表达与肿瘤直径及淋巴结转移呈负相关。然而生存分析显示miR-214对患者的预后无明显影响。3.miR-214可抑制胃癌细胞的增殖、迁移浸润能力,而对细胞凋亡无明显作用。4.靶基因软件 TargetScan 预测提示 FGFR1、CSF1、NOTCH2、CREB1、AGAP2等是miR-214的潜在靶基因。荧光素酶实验和Western blot证实CSF1是miR-214的直接靶基因。结论及意义:miR-214在胃癌组织和多种胃癌细胞系中表达下调,在转移性的胃癌组织中降低更明显。miR-214可抑制胃癌细胞的增殖、迁移浸润能力,而对细胞凋亡无明显影响。CSF1是miR-214的直接靶基因。miR-214对其它靶基因(如CREB1等)的调控作用有待进一步验证。miR-214可下调CSF1的表达,miR-214可能通过调控CSF1发挥了抑制胃癌细胞增殖、迁移浸润的作用。第二部分胃癌中CREB1的表达、预后价值及miRNA对其的调控作用研究目的:1.检测CREB1在胃癌组织中的表达情况。2.分析CREB1在胃癌中的临床意义及预后价值。3.验证CREB1是否受到miR-214等miRNA的调节。研究方法:1.免疫组化检测185例原发灶胃癌组织、50例淋巴结转移灶胃癌组织、50例非肿瘤胃粘膜组织中CREB1蛋白的表达情况。2.使用卡方检验分析CREB1表达与临床病理参数的关系。Kaplan-Meier法及Log-rank检验分析CREB1表达与病人预后的关系。3.使用miRWalk、starBase软件预测可能调控CREB1的miRNA,通过荧光素酶实验、Western blot验证miRNA对CREB1的调控作用。结果:1.CREB1在非肿瘤胃粘膜组织、胃癌原发灶、淋巴结转移灶中呈递增式表达。CREB1表达水平在有淋巴结转移的组织相比于无淋巴结转移的组织中明显升高。2.CREB1的高表达与淋巴结转移、远处转移、肿瘤分期正相关。3.CREB1高表达的患者的总生存时间和无瘤生存时间明显短于CREB1低表达的患者。CREB1与肿瘤分期联合构建的模型,是一个独立的预后因子。4.CREB1 是 miR-27b 和 miR-200b 的直接靶基因,受到 miR-27b 和 miR-200b 的负向调控。结论及意义:CREB1的高表达与胃癌淋巴结转移、肿瘤分期和患者预后不良相关。miR-27b和miR-200b可负向调节CREB1的表达。CREB1是一个有价值的生物标记物,对胃癌淋巴结转移、病人预后有重要提示作用。miR-27b/200b-CREB1信号通路可能为胃癌的治疗提供新的靶点。第三部分CREB1在胃癌中的功能及作用机制初探研究目的:1.探究CREB1在胃癌中的生物学功能。2.鉴定转录因子CREB1的下游靶基因,初步探讨CREB1的作用机制。研究方法:1.在胃癌细胞中过表达CREB1或干扰CREB1的表达,检测其对细胞增殖、迁移浸润能力的影响。2.在胃癌细胞中,利用染色质免疫共沉淀测序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析转录因子CREB1在全基因组的结合谱,筛选CREB1可能调控的 mRNA、miRNA、lncRNA。3.在细胞转染CREB1过表达质粒或CREB1干扰RNA之后,使用实时定量PCR检测CREB1下游候选lncRNA的表达水平。4.使用ChIP-qPCR(染色质免疫共沉淀-实时定量PCR)证实CREB1与lncRNA启动子的结合。结果:1.过表达CREB1能够促进胃癌细胞的增殖、迁移浸润;反之,下调CREB1表达则抑制胃癌细胞的增殖、迁移浸润。2.ChIP-seq结果提示CREB1 可以结合到831 个mRNA、276个IncRNA、62个miRNA的启动子区。3.ChIP-seq的结果与本课题组前期做的胃癌转移相关IncRNA芯片取交集,将候选IncRNA范围缩减为9个。4.通过实时定量PCR验证,发现CREB1可正向调节lncRNALOC100270746、PIN1P1 及 ZEB1-AS1 的表达。5.ChIP-qPCR结果显示CREB1在lncRNA的启动子区有显著富集。结论及意义:CREB1能够促进胃癌细胞的增殖、迁移浸润。LncRNA LOC100270746、PIN1P1及ZEB1-AS1的表达受到CREB1的正向调控。
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【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：R735.2

【参考文献】