大肠癌蛋白标志物的筛

发布时间：2018-02-23 19:44

  本文关键词： 大肠癌 抗体芯片 RANTES/CCL5 ELISA 免疫组织化学　出处：《山东大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：大肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤,也是癌症死亡的第四大常见原因。饮酒、吸烟及饮食结构的改变使得中国人群大肠癌的发病率逐年上升,且越来越年轻化。约50%的患者进展为远处脏器转移,需要手术切除和／或系统性治疗。现已被证明有确切疗效的药物分为细胞毒性(如经典化疗)和靶向药物,其中靶向药物治疗成为晚期大肠癌病人最有希望且毒副作用小的治疗方法。尽管目前关于大肠癌发生相关的信号通路方面已经做了许多研究,但是有助于判断预后的生物指标及可利用的治疗靶基因仍然很少。因此寻找新的治疗靶点进行个体化治疗仍然是众学者不断探索研究的目标之一。在肿瘤发生、发展过程中,其细胞内会发生一系列蛋白质表达的变化。而蛋白质组分析技术的应用,能够从细胞整体水平上显示出肿瘤在发生、进展过程中蛋白质表达谱的变化,有助于进一步认识肿瘤的发生机理,从而加快对肿瘤分子标志物以及肿瘤靶向治疗中的关键因素--靶基因的寻找速度。蛋白质芯片是一种具有高通量、高效及快捷等特点的蛋白质组学研究技术手段,它的出现为开展肿瘤蛋白质组学研究提供了强有力的技术平台。抗体芯片是蛋白芯片的一种,同样具有微型化、集成化和高通量等特点,可以用于检测某一特定的生理过程或者病理过程中相关蛋白质的表达谱,主要用于蛋白质组学、肿瘤、信号转导及其他病变的相关性研究。尽管日本学者已经应用RayBioTM公司.AAH-BLM-1-2抗体芯片分别分析了结肠癌及直肠癌蛋白质的表达谱变化,但其并未对检测结果进一步验证。并且,抗体芯片技术分析的只是蛋白质的抽提物,即只能显示是哪些蛋白质表达异常,而并不能提供是哪一类细胞(肿瘤上皮细胞还是间质细胞)异常表达这些蛋白质。本实验旨在应用一种新的抗体芯片(含274种细胞重要功能蛋白,包括趋化因子、细胞因子、生长因子、溶解酶、血管生成因子及可溶性受体等)采用双抗体夹心法检测结直肠腺癌组织混合样品与正常结直肠黏膜组织混合样品差异表达蛋白质的表达水平,为大肠癌筛选出新的表达异常的蛋白质,从而为大肠癌的早期诊断、判断预后、靶向治疗及疗效评估提供新的分子标志物。通过大量文献复习,发现趋化因子在肿瘤中的作用越来越得到研究者的关注,本研究从抗体芯片的分析结果中,选择一种具有代表性的异常表达的趋化因子-RANTES/CCL5,增加样本量后采用ELISA法进行验证,又采用免疫组化染色法检测了CCL5在大肠癌中的表达部位并进一步评估其与临床病理参数间的关系。研究目的1、检测大肠癌组织中蛋白质表达的差异改变,筛选出癌组织中差异表达的蛋白质。2、从差异表达的蛋白质中挑选一种候选细胞因子RANTES/CCL5,增加样本量检测大肠癌组织及其对应的正常肠黏膜组织中该细胞因子的表达水平,从而验证抗体芯片的检测结果。3、检测大肠癌组织及其对应的正常肠黏膜组织石蜡标本差异蛋白质CCL5的表达情况,观察其与临床病理参数的关系,探讨其在癌组织表达的意义。材料和方法1、选取4例患者大肠癌组织及其正常大肠黏膜组织,应用抗体芯片AAH-CYT-G6-G10(含274种细胞重要功能蛋白)筛选大肠癌组织与其正常结直肠黏膜组织差异表达的蛋白质。以两样本间标准化杂交荧光信号强度差异具有统计学意义(P0.05)作为标准,筛选在大肠癌组织与正常大肠黏膜组织间差异表达的蛋白群。2、从抗体芯片所筛选的差异表达的蛋白质中选出最有研究价值的细胞因子RANTES/CCL5,采用ELISA法进行验证。选取38例患者大肠癌组织及其正常大肠黏膜组织新鲜标本,制备组织匀浆,稀释后离心取上清,与ELISA板上的包被抗体反应,孵育后加入酶标记抗体以及底物显色,ELISA检测仪测各反应孔的O·D值。3、使用免疫组织化学染色的方法检测大肠癌组织及其正常肠黏膜组织石蜡标本中CCL5的表达。选取60例患者大肠癌组织与其对应的正常肠黏膜组织,行免疫组织化学染色(SP两步法),Fast Red显色,判读染色结果,观察CCL5的表达与临床病理参数间的关系。结果1、抗体芯片检测274种蛋白质在大肠癌组织及正常结直肠黏膜中的表达,有25种蛋白质表达组间比较具有统计学意义。其中有11种蛋白质表达明显下调,包括SCF、CCL28、GRO、sTNF-RI、TIMP、VEGF-D、LYVE-1、NCAM-1、XEDAR、PSA-free,14种蛋白质表达明显上调,包括EGF、FGF-7、MCP-2、MDC、RANTES、IL-2Rapha、 MIP-lbeta、E-Selection、Fas Ligand、IP-10、MMP13、Trappin-2、TIMP2、VEGF。2、ELISA结果显示,大肠癌组织中CCL5蛋白浓度为157.50±89.88mg/ml,高于与其对应正常肠黏膜组织114.02±75.57(P=0.037)。3、免疫组化结果显示：在结直癌组织中,肿瘤细胞高表达CCL5,癌旁正常肠黏膜上皮细胞可见弱表达。肿瘤细胞高表达CCL5与淋巴结转移、高肿瘤分期有关(p0.05),而与性别、年龄、发病部位(直肠或结肠)、肿瘤大小、分化程度及血浆CEA蛋白水平不相关。结论1、抗体芯片能够大范围检测蛋白质的表达水平,从而为肿瘤筛选新的分子标志物。2、CCL5在大肠癌细胞中高表达,说明CCL5可能成为一种有助于进一步了解大肠癌发病机制的新的靶蛋白。3、CCL5在大肠癌细胞中的表达与淋巴结转移及高肿瘤分期有关,提示CCL5可能促进了肿瘤的侵袭性生长。4、CCL5作为潜在的癌组织转移的分子标志物以及是否能够成为新的靶向治疗目标需进一步进行体内及体外研究。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：山东大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34

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本文编号：1527390