结直肠癌分子标志物及临床意义研究

发布时间：2018-02-26 01:08

  本文关键词： 结直肠癌 基因突变 辅助化疗 新一代测序技术 分子标志物　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：本论文以我国常见的恶性肿瘤之一结直肠癌(colorectal cancer, CRC)为研究对象,从肿瘤基因突变检测,结肠癌辅助化疗预后相关基因分子标志评估,基于高通量测序的新型生物分子标志筛选几个领域进行探索性研究,内容主要包括两个部分：第一部分 结直肠癌靶向治疗相关分子靶点检测及临床意义研究随着精准医疗时代的到来,基于基因分子分型从而指导临床实践的个体化治疗已经广泛开展。表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor, EGFR)基因下游信号通路中的关键基因如PIK3CA、NRAS、KRAS和BRAF基因在CRC的发生发展中都起到重要作用,大量研究表明KRAS和NRAS基因野生型患者才能从靶向治疗中获益,而PIK3CA和BRAF基因突变状态也会影响患者的治疗效果和预后。在接受根治性手术切除的早期结肠癌中,术后辅助化疗能给患者带来生存获益,然而能够预测疗效和评价预后的基因分子标志较少且有较大争议,因此对相关基因的突变检测和预后关联研究对于指导临床实践有重要意义。本部分具体研究内容如下：第一、中国结直肠癌患者PIK3CA和NRAS基因突变频谱研究。我们利用直接测序法在676例中国CRC患者中检测磷酸肌醇3激酶(phosphotylinosital 3 kinase, PIK3CA)基因第9和20外显子热点区域和神经母细胞瘤RAS病毒癌基因同源物(neuroblastoma RAS viral oncogene homolog, NRAS)基因第12,13和61号密码子突变状态,以明确相关基因突变在中国CRC患者中的分布情况,并结合临床特征进行关联分析。结果表明PIK3CA基因突变率为9.9%(62/625),其中第9外显子突变率为7.0%(45/643),第20外显子突变率为2.7%(17/636)：NRAS基因突变率为4.2%(26/621),其中第12、13和61密码子突变率分别为1.27%(8/630)、0.48%(3/630)和2.02%(13/643)。结合临床资料分析显示PIK3CA基因突变率在结肠肿瘤中高于直肠肿瘤(15.1% vs 6.1%,P0.001),而NRAS基因突变在肿瘤不同分期中突变率不同(P=0.03),且NRAS基因在肿瘤转移中突变率更高(12.2% vs 3.3%,P=0.01)。第二、结肠癌基因突变检测及辅助化疗相关研究。本研究中我们共收集了124例Ⅱ期结肠癌和104例Ⅲ期结肠癌患者肿瘤组织样本,利用直接测序法检测鼠Kirsten肉瘤病毒致癌基因同源物(v-Ki-ras2 Kirsten rat sarcoma viral oncogene homolog, KRAS)基因第12、13和61密码子、鼠类肉瘤病毒癌基因同源物B1 (v-raf murine sarcoma viral oncogene homolog B1, BRAF)基因第11和15外显子热点区域、PIK3CA基因第9和20外显子热点区域和NRAS基因第12、13及61密码子突变状态,随访患者生存状态进行关联分析。结果表明KRAS基因突变率为37.89%(86/227),其中第12密码子突变率为26.87%(61/227)、第13密码子突变率为6.61%(15/227)、第61密码子突变率为3.54%(8/226),BRAF基因突变率为7.02%(16/228),其中第11外显子热点区域突变率为1.75%(4/228),第15外显子热点区域突变率为5.26%(12/228),其中V600E突变为最常见的类型(43.75%,7/16),PIK3CA基因突变率为13.18%(29/220),其中第9外显子热点区域突变率为10.45%(23/220),第20外显子热点区域突变率为2.7%(6/221),NRAS基因突变只存在于Ⅱ期结肠癌中,突变率为0.89%(2/224),突变类型为G12D(1例)和Q61R(1例)。结合患者临床资料分析表明KRAS和BRAF基因在60岁以上人群中突变率更高(P0.05),在Ⅲ期结肠癌中,PIK3CA基因第9外显子(E545K)突变型和肿瘤复发相关(10.7% vs 0.0%,P=0.031)。生存分析表明PIK3CA基因第9外显子(E545K)突变仅在Ⅲ期结肠癌中和患者较差的OS相关(P=0.044),而在DFS中有统计学差异的趋势(P=0.051)。其它基因突变状态和患者生存之间没有相关性。第二部分基于高通量测序技术的结肠癌患者预后和化疗疗效相关基因的筛选及验证肿瘤的发生发展是一个多因素多步骤的复杂过程,涉及到多种基因突变累积和内外环境的影响,新一代测序技术(next generation sequencing, NGS)的蓬勃发展则为我们从基因组层面研究肿瘤提供了帮助。在接受术后辅助化疗的结肠癌中,一直没有合适的基因分子标志物用于疗效评价和预后评估,为此我们收集了20例预后不同的Ⅲ期结肠癌患者肿瘤组织进行全外显子组(whole exome sequencing, WES)测序,并扩大样本验证筛选的差异基因,探索可以用于预后评估的基因分子标志。经过WES测序和Sequenom检测验证,我们发现了6个基因(CD97,ZNF568, WARS2, APPL2, C9orf117, ZNF443)的SNP位点在不同预后组间出现差异(P0.05),在扩大样本验证阶段ZNF568 (rs547483)在不同预后组间存在统计学差异趋势(P=0.08621),结合患者临床特征分析表明在Ⅲ期结肠癌中WARS2基因(rs3790549, CC)在不吸烟患者中频率较高(62.5% vs 35.3%,P=0.041)；在Ⅱ-Ⅲ期结肠癌中WARS2基因(rs3790549, CC)和C9orf117基因(rs497632, AC)在不吸烟患者中频率较高(P0.05),且WARS2基因(rs3790549, CC)在肿瘤不同的T分期中频率不同(P=0.023)。以上两部分的研究内容在中国CRC患者中初步建立了PIK3CA和NRAS基因突变频谱,分析了KRAS、BRAF、PIK3CA和NRAS基因与结肠癌患者临床特征相关性并分析了其在预后评估中的价值；同时利用WES测序技术筛选并探索了新型基因分子标志物在结肠癌辅助化疗中的评价作用。这些研究结果为我们更加深入的了解中国CRC患者和指导临床实践提供可靠的理论依据。
[Abstract]:In the early stage of colorectal cancer ( CRC ) , the mutation rate of PI3CA and NRAS was 7 . 0 % ( 62 / 621 ) , and the mutation rate of PI3CA and BRAF gene was 1.7 % ( 17 / 636 ) . The mutation rate of PI3CA and BRAF gene was 1.7 % ( 17 / 636 ) . The mutation rate of exon 12 , 13 and 61 , mutation rate of exon 12 , 13 and 61 , mutation rate of exon 12 , 13 and 61 of the exon 11 and exon 12 of the exon 12 , 13 and 61 of the exon 11 were 10.45 % ( 23 / 220 ) . The mutation rate of exon 11 was 3.54 % ( 8 / 226 ) . The mutation rate of exon 11 was 10.45 % ( 23 / 220 ) . We collected 20 cases of colon cancer patients with different prognosis and had no correlation between different prognostic groups ( P = 0.023 ) .

【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.34
，

本文编号：1535886