活性氧族在CHO细胞补料批次培养中的作用、机制及调控研究

发布时间：2018-02-26 02:00

  本文关键词： 中国仓鼠卵巢细胞 活性氧族 细胞凋亡 硫辛酸 苹果酸酶-1 抗体表征　出处：《第二军医大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：单克隆抗体(monoclonal antibody,m Ab)药物因具有靶向性高、副作用小、疗效持久等优点,目前已成为肿瘤治疗的重要手段之一。截至2016年2月全球已有21个抗肿瘤单克隆抗体药物获批上市,用于多种实体瘤、血液肿瘤等的治疗。如何进一步提高抗体药物的产量,以满足日益扩大的市场需求已成为亟待解决的技术难题。中国仓鼠卵巢细胞(Chinese hamster ovary,CHO)是目前抗体药物产业中应用最广泛、培养工艺最成熟的真核宿主表达细胞。在CHO细胞工业化大规模培养中细胞凋亡是在培养中后期导致活细胞密度下降,进而影响单抗药物表达量的主要因素之一。细胞有氧代谢过程中产生的活性氧族(reactive oxygen species,ROS)与细胞凋亡密切相关,本课题旨在探究ROS在CHO细胞补料批次培养中的作用、机制和调控方式,从而有效提高单克隆抗体药物的表达量。本课题利用流式细胞术检测批次培养中CHO细胞内ROS水平,结果显示随着细胞密度的增长,ROS水平迅速升高;当细胞生长达到最高密度后细胞活率、活细胞密度均发生骤降。在CHO细胞批次培养中分别加入50、100、200μM过氧化氢(H2O2),发现各组细胞均受到不同程度的生长抑制。这提示细胞内ROS积累与生长衰退有一定关系。本课题从两个方面对CHO细胞培养中ROS水平进行调控。首先是外源途径,即在培养基中额外添加还原性物质硫辛酸。在批次培养中分别向培养基中添加0、25、50、100与200μM硫辛酸,结果显示100μM组活细胞密度积分(IVCD)最高,为54.65×106 cells/m L days,因此将补料批次培养中硫辛酸的添加浓度设为100μM。应用荧光探针DCFH-DA检测对照组与硫辛酸组细胞内ROS水平,结果显示在培养第五至八天硫辛酸组细胞的ROS水平均显著低于对照组;使用台盼蓝拒染法描记CHO细胞生长、活率图,结果显示在培养中后期,与对照组相比100μM硫辛酸组的活细胞密度、细胞活率、IVCD均显著增高;同时利用高效液相色谱法检测培养终末期对照组细胞上清抗体浓度为0.88 g/L,硫辛酸组浓度为1.04 g/L,表达量提高约18.0%,具有统计学差异(p0.05);在抗体表征方面,还原与非还原性SDS-PAGE实验结果显示,硫辛酸组细胞表达的单克隆抗体分子在二硫键修饰上与对照组一致;通过液质联用技术检测抗体N-糖基化修饰,结果表明两组的主要糖型种类及所占比例无显著差异;同时我们通过Annexin V/PI法检测两组细胞凋亡率,结果显示在补料批次培养第八至十天硫辛酸组细胞凋亡率均显著低于对照组细胞,且western blot实验证实,培养后期对照组凋亡发生相关蛋白Caspase-7剪切体表达水平高于硫辛酸组细胞。以上实验结果表明,硫辛酸显著降低了CHO胞内ROS水平,抑制补料批次培养中后期细胞凋亡,提高了活细胞密度积分及单克隆抗体表达量。第二方面是通过内源途径对ROS水平进行调控。苹果酸酶-1(malic enzyme 1,ME-1)主要作用是催化胞浆内苹果酸氧化脱羧,此过程同时伴随NADP+的还原反应。本课题利用基因工程技术构建了pc DNA3.0-ME-1真核表达载体,细胞转染后通过抗生素筛选得到稳定表达ME-1基因的CHO细胞库(CHO-ME-1 pool)。在CHO-ME-1细胞与对照组细胞的补料批次培养中,检测显示在对数生长期CHO-ME-1组细胞内ROS水平显著低于对照组。细胞生长活率方面,从培养第八天直至培养终末期,CHO-ME-1组的活细胞密度、细胞活率均高于对照组,IVCD值提高了约33.0%,抗体表达量提高了约16.9%,差异具有统计学意义(p0.01)。抗体药物表征研究结果显示,CHO-ME-1细胞表达的抗体在分子量、二硫键修饰、N-糖基化修饰等方面与对照组没有显著差异,符合预期质量标准。同时在细胞培养中后期,CHO-ME-1组细胞凋亡率、Caspase-7活化剪切体的表达水平均显著低于对照组(p0.01)。本课题发现,ROS的过量累积会对CHO细胞生长产生抑制作用,通过建立内源、外源两种途径可以有效降低细胞内ROS水平,优化CHO细胞在补料批次培养中的生长、提高IVCD与抗体表达量,并且对单克隆抗体药物的关键质量属性未产生显著影响。该方法的建立将对CHO细胞无血清培养基的优化、培养工艺的开发及新型高表达细胞株的构建、筛选等工作具有重要指导作用,也为我国抗体药物产业的进一步发展提供技术支持。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R73-36

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本文编号：1536036