第一部分：AJUBA通过上调MMP10和MMP13表达促进食管鳞癌细胞侵袭转移机制的研究 第二部分：5-hmC表达下调是

发布时间：2018-02-28 00:11

  本文关键词： 食管鳞癌 AJUBA ERK 基质金属蛋白酶10 基质金属蛋白酶13 5-羟甲基胞嘧啶 甲基胞嘧啶双加氧酶 食管鳞癌 术后生存　出处：《北京协和医学院》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：在全世界范围内,食管癌的发病率在全部恶性肿瘤中排名第8位,其死亡率在全部恶性肿瘤中排名第6位。食管癌以鳞癌为主要病理类型,在我国食管鳞癌占到食管癌总数的90%以上。在过去的几十年中,在食管癌的诊断、分期以及治疗等方面都取得了较大的进步,但是食管癌的总体生存率仍然没有明显改善,总体五年生存率仍然在15%至25%之间。因此亟需研究食管癌发生发展过程中具体的分子机制,为食管癌寻找新的肿瘤标志物和治疗靶点。AJUBA属于Zyxin/Ajuba家族成员,包含三个串联重复的LIM结构域和富含脯氨酸的Pre-LIM结构域,能以脚手架蛋白的身份与多种蛋白或DNA结合,参与组织器官的发育调控,并且在细胞粘附、增殖、迁移、细胞命运决定等方面发挥作用。到目前为止AJUBA在食管鳞癌中的表达水平,具体的生物学功能以及作用机制尚不明确。在本研究中,我们首先分析了表达谱芯片中179对食管鳞癌及相应癌旁组织中AJUBA的mRNA水平,并且使用免疫组化的方法在81例食管鳞癌组织和60例癌旁组织中进行AJUBA蛋白水平的验证,结果显示在食管鳞癌组织中存在AJUBA表达水平的广泛上调,进一步的分析发现AJUBA的高表达与肿瘤组织的分化和T分期相关。通过慢病毒载体系统在食管鳞癌细胞KYSE450、 KYSE510和KYSE180中敲降AJUBA基因能显著抑制肿瘤细胞的增殖和迁移、侵袭能力,反之,在KYSE450和KYSE510中稳定过表达AJUBA则能促进肿瘤细胞的迁移和侵袭。裸鼠成瘤实验和尾静脉注射肺定植实验证实了AJUBA在体内也能促进食管鳞癌细胞的增殖和远处转移。RNA测序是一种全转录本分析技术,可测出包括mRNA在内的转录组序列,反映其表达水平,具有高通量,高敏感度,高准确度等优点。在本研究中我们敲降KYSE450. KYSE510和KYSE180由AJUBA的表达水平后,使用RNA测序的方法检测AJUBA敲降前后差异表达的基因并将差异表达基因进行GO功能富集分析,发现AJUBA敲降前后差异表达的基因主要在细胞粘附、运动、连接等方面发挥作用。在这些差异表达的基因中,MMP10和MMP13的表达水平在AJUBA敲降后显著降低,分别降低5.6倍和5.5倍。进一步分析179例食管鳞癌组织中MMP10、 MMP13和AJUBA的mRNA表达水平,发现MMP10, MMP13与AJUBA之间呈正相关关系,相关系数分别为r=0.441,P0.001和r=0.404,P0.001。探讨机制后发现,AJUBA能够通过增强ERK的磷酸化水平上调MMP10和MMP13的表达,从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。此外,AJUBA还能增强食管鳞癌细胞对顺铂诱导凋亡的抵抗作用,促进肿瘤细胞的存活。综上所述,我们的研究证实,AJUBA基因在食管鳞癌组织中存在普遍的高表达现象,高表达的AJUBA能促进食管鳞癌细胞的增殖、侵袭、转移以及增强肿瘤细胞对顺铂诱导凋亡的抵抗,有可能成为食管鳞癌治疗的新靶点。DNA胞嘧啶甲基化是最重要的表观遗传学修饰之一。DNA胞嘧啶甲基化参与了基因组印记、X染色体失活、基因表达调节等多种生物学过程。在哺乳动物基因组中,胞嘧啶甲基化主要发生于CpG二核苷酸处,最初由从头甲基化转移酶Dnmt3a和Dnmt3b催化生成,在DNA复制过程中,生成的5-甲基胞嘧啶(5-mC)在维持性甲基化转移酶Dnmt1的作用下被维持下来。甲基胞嘧啶双加氧酶(TET),是一类Fe(2+)和a-酮戊二酸依赖性的双加氧酶,能够催化5-mC形成5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC),生成的5-hmC还能进一步被TET酶催化生成5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),在DNA去甲基化中发挥重要作用。在哺乳动物细胞中共有3个TET基因,分别为TET1,TET2和TET3,TET1/2/3均能催化5-mC形成5-hmC,并且具有组织特异性。研究报道在多种肿瘤中发现5-hmC水平的降低,并且降低的5-hmC可以作为肿瘤的一个重要的表观遗传学标记。在本研究中,我们使用免疫组化法检测了173例食管鳞癌组织和91例相应远癌正常组织中5-hmC的水平；并在另外50对食管鳞癌组织和相应远癌正常组织中用DNA斑点杂交法检测了5-hmC的水平。进一步利用实时定量PCR (RT-qPCR)检测了这50对食管鳞癌组织和相应远癌正常组织中TET1, TET2和TET3的mRNA表达水平,并与5-hmC水平进行了相关性分析。免疫组化结果显示在91例远癌正常组织中,56例为5-hmC阳性,阳性比例为62%；在173例食管鳞癌组织中,82例为5-hmC阳性,阳性比例为47%,显著低于远癌正常组织(P=0.029)。DNA斑点杂交的结果进一步支持了5-hmC在食管鳞癌中的水平显著低于相应的远癌正常组织(P0.0001)。我们进一步分析了5-hmC水平与食管鳞癌患者临床病理因素及术后生存之间的关系,结果显示在食管鳞癌中,5-hrnC的表达下调与食管鳞癌患者的预后不良显著相关(P=0.043)。多因素Cox回归分析进一步表明5-hmC表达下调是食管鳞癌患者独立的不良预后因素但R=1.569,P=0.029)。RT-qPCR结果显示TET2和TET3在食管癌中的表达水平显著低于相应的远癌正常组织(TET2,P0.0001；TET3,P=0.009),进一步分析发现5-hmC水平的降低与TET2表达水平下调显著正相关(r=0.405,P=0.004)。除了TET基因的表达下调外,研究报道TET基因或异柠檬酸脱氢酶1和2(IDH1/2)基因的突变也可导致5-hmC水平的降低。在免疫组化检测的173例食管鳞癌组织中,105例标本具有全外显子的测序数据。我们分析了这105例标本中TET基因和IDH基因序列的异常,结果表明12例病例发生了TET或IDH1基因序列变异,这105例标本中未发现IDH2基因序列变异。进一步分析表明发生TET或IDH1基因序列变异的标本中,5-hmC水平低于未发生TET或IDH1基因序列变异的病例,但差异暂不具有统计学意义(P=0.051)。综上所述,本研究结果表明食管鳞癌中5-hmC水平发生显著下调,并且5-hmC的表达下调是食管鳞癌患者独立不良预后因素。
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【学位授予单位】：北京协和医学院
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.1
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本文编号：1544923