睾丸孤核受体4（TR4）在肾透明细胞癌侵袭转移中作用及其机制的研究

发布时间：2018-02-28 04:40

  本文关键词： 肾透明细胞癌 侵袭转移 睾丸孤核受体4 miR-32-5p circ_000002　出处：《浙江大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：研究背景和目的：肾透明细胞癌(Clear Cell Renal cell carcinoma, ccRCC)是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤,是常见的泌尿系统恶性肿瘤。肾透明细胞癌起病较隐匿,大多无典型的临床表现,早期诊断率不高,其中大约30%患者在诊断时已发生转移,失去手术机会。转移性肾透明细胞癌的治疗目前主要依赖靶向治疗,但其平均有效时间仅6-15个月。因此,深入研究肾透明细胞癌转移的机制,寻求更好的治疗转移性肾透明细胞癌的方法显得尤为重要。近两年我们的研究发现TR4可以通过CCL2/CCR或者miR-373-3p促进前列腺癌的迁移和侵袭,亦可影响前列腺癌干细胞的侵袭和迁移能力促进前列腺癌转移,并且我们也发现TR4可以促进前列腺癌的化疗抵抗和放疗抵抗。TR4在前列腺癌转移以及前列腺癌放化疗抵抗中的作用已逐渐得到研究人员的认可并引起重视,而关于TR4在肾癌中的作用尚未见报道。在本研究中,我们探索了TR4在ccRCC侵袭转移中的作用,并通过运用分子生物学方法阐述其具体机制。研究方法和结果：1.TR4在人类ccRCC组织标本和细胞株中的表达、与患者预后相关性及其在ccRCC侵袭转移中功能的研究我们通过对ccRCC患者组织标本进行免疫组织化学染色发现转移性ccRCC患者肾癌组织中TR4表达明显高于非转移性ccRCC患者,并且通过TCGA数据库发现TR4与ccRCC患者的预后呈负相关,进一步在细胞水平发现TR4在侵袭能力较强的ccRCC细胞株中表达相对较高,并且通过调控细胞株内TR4表达水平在细胞进一步验证TR4促进ccRCC侵袭转移的作用。2.TR4通过miR-32-5p/TR4/HGF/Met信号通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究我们运用Western blot, CbIP、双荧光素酶报告基因实验、拯救实验等方法在细胞层面证明TR4可以通过转录调控上调HGF/Met/MMP2/MMP9通路的表达促进ccRCC侵袭转移,miR-32-5p可以抑制TR4及TR4下游通路HGF/Met/MMP2/MMP9的表达进而抑制ccRCC侵袭转移,并且miR-32-5p可以通过与TR43'UTR的结合抑制TR4的表达。最后通过动物实验进一步验证细胞实验的结果。3.TR4通过上调circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1通路促进ccRCC侵袭转移的具体机制研究我们运用qRT-PCR、Western blot、ChIP、双荧光素酶报告基因实验、拯救实验、RNA-pulldown等方法证明TR4可以通过转录调控上调circ_000002的表达,而circ_000002可以和miR-19s-3p、miR-29s-3p结合,影响其分布进而促进其下游IGF-1的表达,最终促进ccRCC侵袭转移。研究结论：本研究在ccRCC组织标本中发现TR4在转移性ccRCC中高表达,并在细胞层面、动物层面验证TR4可以促进ccRCC侵袭转移,进一步在细胞层面探索其具体机制发现TR4可以通过上调HGF/Met/MMP2/MMP9通路活性促进ccRCC侵袭转移,并且发现其上游分子miR-32-5p可以靶向TR4抑制TR4的表达及其下游HGF/Met/MMP2/MMP9通路。此外我们也发现TR4也可以通过上调circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1通路活性促进ccRCC侵袭转移。
[Abstract]:Background and objective: clear Cell Renal cell carcinoma (ccRCCs) is a malignant tumor originating from the renal parenchymal urothelial system and a common malignant tumor of the urinary system. The early diagnosis rate is not high, about 30% of them have metastasized at the time of diagnosis and have lost the opportunity of operation. The treatment of metastatic clear cell renal cell carcinoma is mainly dependent on targeted treatment, but its average effective time is only 6-15 months. It is particularly important to study the mechanism of metastasis of renal clear cell carcinoma and to find a better treatment for metastatic renal clear cell carcinoma. In the last two years, we have found that TR4 can promote the migration and invasion of prostate cancer through CCL2/CCR or miR-373-3p. It also affects the ability of prostate cancer stem cells to invade and migrate to promote the metastasis of prostate cancer, We also found that the role of TR4 in promoting chemotherapy resistance and radiotherapy resistance of prostate cancer. TR4 in prostate cancer metastasis and chemoradiotherapy resistance of prostate cancer has gradually been recognized and paid attention to by researchers. However, the role of TR4 in renal cell carcinoma has not been reported. In this study, we explored the role of TR4 in the invasion and metastasis of ccRCC. The expression of TR4 in human ccRCC tissues and cell lines was studied by molecular biology. Correlation with prognosis and its role in ccRCC invasion and Metastasis; the expression of TR4 in metastatic ccRCC patients was significantly higher than that in non-metastatic ccRCC patients by immunohistochemical staining. TCGA database showed that TR4 was negatively correlated with the prognosis of ccRCC patients, and the expression of TR4 was relatively high in ccRCC cell lines with strong invasiveness at the cellular level. The effect of TR4 on the invasion and metastasis of ccRCC was further verified by regulating the expression of TR4 in the cell line. 2. The specific mechanism of promoting the invasion and metastasis of ccRCC by miR-32-5p/TR4/HGF/Met signaling pathway was studied. We used Western blot, CbIPand double luciferase reporter gene experiment. At the cell level, it was demonstrated that TR4 could up-regulate the expression of HGF/Met/MMP2/MMP9 pathway through transcriptional regulation to promote the invasion and metastasis of ccRCC. MiR-32-5p could inhibit the expression of HGF/Met/MMP2/MMP9 in TR4 and TR4 downstream pathway and then inhibit ccRCC invasion and metastasis. And miR-32-5p can inhibit the expression of TR4 by binding with TR43'UTR. Finally, we further verify the results of cell experiment by animal experiments. 3. TR4 can promote the invasion and metastasis of ccRCC through up-regulation of circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1 pathway. Enzyme reporter gene experiment, Rescue RNA-pulldown method showed that TR4 could up-regulate the expression of circ_000002 through transcriptional regulation, while circ_000002 could bind to miR-19s-3pnmiR-29s-3p, which affected its distribution and promoted the expression of IGF-1 downstream. In this study, we found that high expression of TR4 in metastatic ccRCC was found in ccRCC tissues, and at the cell level, it was demonstrated that TR4 could promote invasion and metastasis of ccRCC. Further exploring its specific mechanism at the cellular level, we found that TR4 can promote the invasion and metastasis of ccRCC by up-regulating the activity of HGF/Met/MMP2/MMP9 pathway. It was also found that upstream miR-32-5p could target TR4 to inhibit the expression of TR4 and its downstream HGF/Met/MMP2/MMP9 pathway. In addition, we also found that TR4 could promote ccRCC invasion and metastasis by upregulating the activity of circ_000002/miR-19s-3p/miR-29s-3p/IGF-1 pathway.
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R737.11

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本文编号：1545801