干扰素诱导基因SLFN5在肝细胞癌中的表达及其抗增殖作用机制研究

发布时间：2018-02-28 04:34

  本文关键词： 肝细胞癌 干扰素 SLFN5 Stat3 p53　出处：《重庆医科大学》2016年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分SLFN5在人肝癌组织中的表达情况及其临床意义目的:Schlafen(Slfn)基因家族作为干扰素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)亚群,参与干扰素抗病毒、抗肿瘤、调节免疫等生物学功能。近年,人们逐渐认识到SLFN5在抑制干扰素治疗敏感的恶性黑色素瘤、肾细胞癌的生长及侵袭方面发挥的作用。而SLFN5在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表达情况,及其与HCC相关临床指标之间的关系尚不清楚,因此我们拟通过本研究对SLFN5在HCC样本中的表达情况及其临床意义进行评价。方法:通过Real-time PCR,免疫组织化学和western-blot等技术检测SLFN5基因及蛋白在HCC患者肝癌组织及配对癌旁组织中的表达情况,分析90例HCC组织芯片SLFN5蛋白的表达水平与临床指标之间的关联性,进行Kaplan-Meier生存分析并对危险因素进行Cox风险回归,评判SLFN5与HCC预后的关系。结果:肝细胞癌组织中SLFN5的表达量显著低于相应癌旁非癌组织。考虑到每例患者肝癌组织相对癌旁肝组织SLFN5表达变化的程度不同。为了反应这种内在的差异,我们构建了一个新的变量ΔSLFN5(Δslfn5=配对的癌旁肝组织slfn5蛋白表达量-肝细胞肝癌组织slfn5蛋白表达量)分析其与临床各相关指标之间的关系。结果显示,Δslfn5与hcc的恶性生物学行为有关,即随病理分级增加,肿瘤tnm分期增加,肿瘤直径增大,肝癌组织中slfn5下降程度增大(Δslfn5增高),(相应的p=0.003;p=0.014;p=0.017)。cox风险比例模型进行回归分析,统计结果显示Δslfn5≥150(p=0.031;hr:4.101;95%ci:1.135 14.815)可能是肝细胞癌患者术后生存期的独立危险因素。结论:肝癌组织的slfn5表达均显著低于癌旁组织,肝癌组织中slfn5下降越多,对应越高的病理分级,更高的tnm分期和较大的肿瘤直径。kaplan-meier生存分析表明,Δslfn5≥100或150预示较差的术后生存期。cox比例风险回归模型结果显示,Δslfn5≥150是临床不良预后的独立危险因素(p=0.031;hr:4.101)。第二部分:slfn5对体外培养人肝癌细胞增殖抑制作用及其机制研究目的:在第一部分研究中我们发现slfn5在人hcc组织中表达降低,且slfn5表达降低的程度与hcc恶性生物学行为(更高的病理分级、更高的tnm分期及更大的肿瘤直径)及不良预后有关。本部分主要在体外细胞模型上,观察slfn5表达变化对hcc细胞生长的影响并探讨其可能的机制。方法:首先进一步对slfn5在体外肝癌细胞系及正常肝细胞系中的表达差异进行验证,然后通过脂质体转染技术和慢病毒载体感染方法,分别下调及上调slfn5蛋白在hcc细胞的表达,采用cck8法检测细胞增殖、流式细胞仪检测细胞周期、凋亡等实验方法观察转染slfn5-siran及感染重组慢病毒lv5-slfn5前后细胞增殖、周期、凋亡等相关细胞生物学行为的变化。从正反两个方面说明slfn5蛋白对hcc细胞生长的可能影响。结果:slfn5mrna及蛋白水平的表达在正常人肝细胞l02中均明显高于smmc-7721、huh-7、hepg2及bel7402等hcc细胞,细胞免疫荧光显示slfn5在肝癌细胞中的表达定位以细胞核为主。进一步在smmc-7721及huh-7细胞干扰或过表达slfn5基因后发现,与阴性对照组相比,干扰slfn5促进了smmc-7721细胞的增殖,而slfn5过表达后显著地抑制了smmc-7721的增殖;但无论下调还是上调slfn5的表达,对huh-7细胞增殖无明显的影响。干扰slfn5导致smmc-7721细胞周期进程加快,g1期比率减少,s期及g2/m期增加,增殖指数s+g2/m明显增加。过表达slfn5导致smmc-7721细胞s期比率增高,而g2/m细胞比率减少,发生细胞周期s期阻滞。干扰或者过表达slfn5对huh-7的细胞周期进程无影响;干扰或者过表达slfn5对smmc-7721及huh-7细胞凋亡无明显影响。wb检测结果显示,在smmc-7721细胞,干扰slfn5基因,可能通过上调cyclind1、cycline、cyclina和激活型cdk2(thr160)等相关细胞周期蛋白及周期蛋白依赖性蛋白激酶促进周期进程。过表达slfn5则导致周期蛋白及周期蛋白依赖性激酶相反的变化趋势,进而导致周期阻滞。结论:与人肝癌组织ihc检测结果一致,slfn5在正常人肝细胞中表达明显高于hcc细胞。slfn5在肝癌细胞主要表达于肝细胞核。下调slfn5的表达可以促进细胞周期进程,促进细胞增殖。而上调slfn5表达则通过抑制细胞周期蛋白及相应的周期蛋白依赖性激酶的表达,促使hcc发生细胞周期s期阻滞,从而抑制细胞增殖。huh-7细胞增殖、周期、凋亡均不受slfn5表达改变影响。第三部分:slfn5基因与Ⅰ型ifnα相关信号通路关系初探目的:既往学者研究小鼠slfn2基因时发现,ifnα诱导slfn基因家族成员的表达不同程度依赖于stat1、stat3以及p38信号分子。但其中slfn5的诱导表达不仅不依赖于stat3分子,反而在stat3-/-敲除的小鼠胚胎成纤维细胞(mef)上ifnα诱导slfn5较stat3野生型mef细胞成倍增加。提示slfn5与stat3分子之间可能存在某种相互调控机制,而鼠的slfn5与人的slfn5是一对直系同源基因,因此,在本部分研究中我们首先证实ifnα是否也能诱导hcc细胞slfn5的表达;其次拟对slfn5与ifnα下游信号通路jak-stat、pi3k/akt中的关键信号分子stat3及akt之间可能存在的调控关系进行研究,以期对slfn5在hcc中的抗增殖作用的机制有更深入的理解。方法:本部分通过real-timepcr、免疫印迹、细胞共转染技术与双荧光素酶报告基因检测技术分析干扰素刺激hcc细胞slfn5mrna及蛋白表达情况;slfn5表达改变对hcc细胞stat3、akt信号分子表达的影响以及对stat3转录活性的影响;并对调控stat3组成性激活的上游分子p53表达情况进行检测,以探讨slfn5影响stat3转录调控的可能机制。结果:ifnα刺激可诱导除bel-7402以外的hcc细胞和l02细胞slfn5mrna及蛋白的表达。同时发现,hepg2与smmc-7721中p-stat3、slfn5的基线表达情况与我们推测的相符,二者之间似乎存在负向调节关系,即hepg2中p-stat3表达高于smmc-7721,slfn5则低于smmc-7721。进一步在smmc-7721细胞上干扰slfn5,结果再次印证我们的假设,slfn5表达下调导致了p-stat3表达增加;反之,slfn5过表达则抑制了p-stat3的表达。二者对t-stat3的表达均无影响。对hcc细胞共转染相应的slfn5-sirna或pcmv6-slfn5-gfp及stat3的sie荧光素酶报告质粒后stat3转录活性变化进行了检测。结果进一步证实,slfn5可以负调控stat3的转录活性。我们发现slfn5可以正向调节p53野生型细胞smmc-7721的p53蛋白及其下游靶基因p21的表达;而slfn5对p53突变型细胞huh-7的p53蛋白及其下游靶基因p21无明显调控作用。slfn5还可以抑制pi3k-akt信号通路中akt信号分子磷酸化。结论:ifnα可明显诱导正常人肝细胞及hcc细胞slfn5mrna及蛋白的表达;slfn5可以负调控stat3的705位点酪氨酸残基磷酸化,进而负调控stat3的转录活性,并负调控stat3下游靶基因cyclind1,抑制hcc细胞增殖。slfn5上调或下调可以影响p53野生型smmc-7721细胞的p53及下游蛋白p21的表达,而不能影响p53突变的Huh-7细胞,提示SLFN5对Stat3的磷酸化调控作用有可能是野生型p53依赖的。SLFN5也可以抑制PI3K-Akt信号通路中Akt磷酸化,提示SLFN5抗增殖作用的机制是多因素、多环节参与的复杂的网络调控机制。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R735.7

【相似文献】

相关期刊论文 前10条

1 ;早期发现肝细胞癌可增加治疗机会[J];河南医学研究;2000年02期

2 Schafer DF,潘朝法,李苏云;肝细胞癌[J];第四军医大学吉林军医学院学报;2000年01期

3 中沼安二,林淑兰,姚桢;有关小肝细胞癌病理学的最新认识[J];日本医学介绍;2000年05期

4 静雨;;美国肝细胞癌发病率增高[J];国外医学情报;2000年01期

5 张玉勋;;肝细胞癌的非手术治疗[J];国外医学情报;2000年05期

6 徐宏勇,李开宗,付由池,窦科峰,李景梦,何扬举;bcl-x,bax基因表达与肝细胞癌临床病理特征的关系[J];第四军医大学学报;2001年14期

7 蔡端;多中心源肝细胞癌的特征:与肝内转移的比较[J];国外医学.外科学分册;2002年02期

8 张春平;与白介素-18水平升高有关的肝细胞癌自发性消退[J];国外医学(内科学分册);2003年03期

9 薛海鸥,岳莉;儿童肝细胞癌1例报告[J];锦州医学院学报;2003年04期

10 德力,白志刚,牧荣,赖玉书,金灿浩,夏医君;血管内皮细胞生长因子在肝细胞癌中的表达和预后的关系[J];内蒙古医学杂志;2003年04期

相关会议论文 前10条

1 卞读军;;肝细胞癌经导管动脉化疗栓塞前后磁共振波谱研究[A];2009中华医学会影像技术分会第十七次全国学术大会论文集[C];2009年

2 贾建伟;赵洁;;肝细胞癌领域研究现状与进展[A];中医药防治感染病之研究（九）——第九次全国中医药防治感染病学术交流大会论文集[C];2009年

3 陈孝平;;肝细胞癌外科治疗进展[A];湖北省第21届肿瘤学术大会论文汇编[C];2011年

4 张杰;刘军建;韩云;张宁;芮静安;金城;周柔丽;;用荧光差异显示法筛选肝细胞癌相关新基因[A];2000全国肿瘤学术大会论文集[C];2000年

5 冯仕庭;李子平;谭国胜;孙灿辉;彭振鹏;;中晚期肝细胞癌的多层螺旋CT血管造影表现及临床应用[A];中华医学会第十三届全国放射学大会论文汇编（下册）[C];2006年

6 张法标;方哲平;王义;董辉;丛文铭;;上皮钙粘素和β-连接素在儿童肝细胞癌中的表达及其临床意义[A];2007年浙江省外科学学术会议论文汇编[C];2007年

7 陈钟杰;;螺旋CT诊断原发型肝细胞癌28例[A];2008年浙江省放射学年会论文汇编[C];2008年

8 贾克东;;肝细胞癌的诊断进展及治疗现状[A];全国中西医结合肝病新进展讲习班、江西省第二次中西医结合肝病学术会议资料汇编[C];2010年

9 李秋萍;龙顺钦;杨小兵;邓宏;蔡姣芝;潘宗奇;河文峰;周宇姝;欧阳育树;廖桂雅;吴万垠;;癌服灵治疗晚期肝细胞癌的临床研究[A];2012·中国医师协会中西医结合医师大会第三次会议论文集[C];2012年

10 朱明华;祝峙;刘晓红;林静;曲建慧;陈颖;曹晓哲;王力;倪灿荣;;乙型肝炎病毒感染与肝细胞癌发生关系的分子病理学研究[A];中华医学会病理学分会2009年学术年会论文汇编[C];2009年

相关重要报纸文章 前10条

1 中国抗癌协会临床肿瘤学协作专业委员会主任委员 秦叔逵;治疗肝细胞癌 别只盯着靶向药[N];健康报;2013年

2 记者 王丹 管九苹;肝细胞癌标志物研究获新进展[N];健康报;2013年

3 吴一福;四军医大唐都医院发现硒蛋白P与肝细胞癌发生有关[N];中国医药报;2007年

4 黎彬;肝癌研究重要进展——预测肝癌转移成为可能[N];中国医药报;2004年

5 钱文彩;α2δ1阳性细胞为新的肝细胞癌干细胞[N];中国医药报;2013年

6 新美;基础研究进展推动肝脏病学进步[N];中国医药报;2008年

7 周金莲;MIB-1和bcl-2表达预测肝癌发生[N];中国医药报;2004年

8 张金山;要灵活运用影像学提供的方法和手段[N];中国高新技术产业导报;2001年

9 李杰;不能手术切除肝细胞癌的治疗[N];科技日报;2006年

10 ;修复肝细胞 改善肝功能[N];人民日报海外版;2006年

相关博士学位论文 前10条

1 白兰;乙肝病毒捕获细胞因子和信号级联以逃避宿主免疫并维持持续感染[D];武汉大学;2014年

2 何洪卫;肝细胞癌内γδT细胞浸润减少及功能缺陷的机制研究[D];复旦大学;2014年

3 蔡晓燕;淋巴细胞在肝细胞癌和癌旁组织中的差异性表达研究[D];复旦大学;2014年

4 向导;细胞周期因子FoxM1促进肝脏再殖的研究[D];第二军医大学;2015年

5 康富标;共刺激分子B7-H3在肝细胞癌的表达及相关机制研究[D];中国人民解放军医学院;2015年

6 杨纯;Gankyrin正反馈调控Nrf2在肝细胞癌中发挥抗氧化作用[D];第二军医大学;2015年

7 陈媛媛;BTG2与肝细胞癌放疗敏感性的相关研究[D];第三军医大学;2015年

8 高霞;PNPLA3基因单核苷酸多态性及基因表达与乙肝病毒感染易感性及乙肝相关肝细胞癌的关联性研究[D];河北医科大学;2016年

9 彭晨星;microRNA结合位点单核苷酸多态性对肝细胞癌预后影响的相关性研究[D];河北医科大学;2016年

10 田伟;γδT细胞免疫治疗肝细胞癌的实验研究[D];山西医科大学;2016年

相关硕士学位论文 前10条

1 陈中博;咖啡摄入与肝细胞癌发病风险的Meta分析[D];河北医科大学;2015年

2 张华鹏;核受体辅激活蛋白5在肝细胞癌组织中的表达及其临床意义[D];郑州大学;2015年

3 郭慧敏;血清sCD25测定在肝细胞癌诊断中的意义[D];郑州大学;2015年

4 凌青霞;双氧化酶1（Duox1）在肝细胞癌中的表达调控及作用研究[D];复旦大学;2014年

5 李会芬;血清Talin-1在肝细胞癌诊断中的作用[D];郑州大学;2015年

6 赵占学;ILK与TNFAIP8在肝细胞癌中的表达及相互关系[D];青海大学;2016年

7 邢时龙;2型糖尿病与乙型肝炎病毒相关肝细胞癌的相关性研究[D];山西医科大学;2016年

8 韦义;TRPV3在肝脏肿瘤中的表达及其与肝癌发展关系的研究[D];山西医科大学;2016年

9 刘菁;旋毛虫ES抗原诱导DC对肝细胞癌预防性作用的实验研究[D];吉林大学;2016年

10 熊淑晨;HULC在肝细胞癌中表达的病理学意义及与上皮间质转化作用的探讨[D];新疆医科大学;2016年

，

本文编号：1545781