FAT4抑制胃癌侵袭转移的作用与机制研究

发布时间：2018-02-28 14:48

本文关键词： FAT4 胃癌肿瘤转移 Wnt/β-catenin 上皮间质转化胃癌表达芯片加权基因共表达分析生存分析进展期胃癌 D2淋巴结清扫腹腔镜辅助胃切除术近端胃癌　出处：《第二军医大学》2015年博士论文　论文类型：学位论文

【摘要】：第一部分FAT4抑制胃癌侵袭转移的作用与机制研究研究背景和目的在全球范围内,胃癌发病率位于男性的第四位,女性的第五位,但其死亡率与发病率第一位的肺癌相当。2008年调查,在全球范围内,胃癌的发病率占所有恶性肿瘤的8%,死亡率则达到了10%。在我国,胃癌的发病率和死亡率均显著高于西方国家,中国每年死于胃癌约有22.7万人,占所有恶性肿瘤死亡的23%。侵袭转移是恶性肿瘤的重要特征,也是其致死性的关键因素。肿瘤的侵袭转移涉及许多信号通路、分子的相互作用,是肿瘤研究关注的一个焦点,目前对其研究都尚处于起步阶段。胃癌的高致死率与其侵袭转移的特性存在密切联系,研究影响胃癌转移侵袭的机制具有重要和现实的意义。脊椎动物的FAT4基因是果蝇ft基因的同源基因。ft基因在果蝇整个发育过程中参与调控Hippo通路和平面细胞极性(PCP),是果蝇7个抑癌基因中的一个。虽然对于FAT4在脊椎动物中是否也同样参与Hippo通路的调控还存在争议,但是目前已有的研究已经提示FAT4与多种恶性肿瘤存在相关性。近几年,基于全基因组的研究,对于FAT4与恶性肿瘤的相关性又有了新的发现。2011年一项对恶性胶质瘤进行全基因组测序的研究显示21%的样本存在FAT4的错义或无义突变。在胰腺癌、HCV相关肝细胞癌及头颈部鳞癌中也报道了存在FAT4的错义或无义突变。据Yu-Hsuan Wu等最新研究报告,利用疱疹病毒上调miRNA31从而下调FAT4表达可以促进内皮细胞的运动和转移,提示FAT4可能在癌细胞的迁移和转移中具有重要的作用。同时,Bossuyt W最新报道FAT4作为一个细胞粘附性蛋白影响细胞的迁移运动。这些研究提示FAT4可能作为癌细胞侵袭转移的抑制因子起作用。2012年5月据Zang ZJ等报道,在复发性胃癌外显子测序中发现,FAT4可能是导致胃癌复发和转移的一个重要的抑癌基因,并在细胞水平证实了FAT4低表达可以促进胃癌细胞的侵袭、转移。由于国际上对于FAT4的研究较晚,目前的研究结果多局限于发现其与某种肿瘤的相关性。对于FAT4怎样发挥其抑癌作用,怎样负向调节胃癌细胞的侵袭、转移还没有明确报道。YAP基因是Hippo信号通路下游的效应分子,可被上游激酶磷酸化而被滞留在胞质内,研究显示在Hippo信号通路中,磷酸化的YAP可通过直接结合胞质内p-catenin而抑制其核移位,从而抑制wnt/β-catenin信号通路。已有报道称YAP在胃癌中具有致癌作用。在以往经典的研究中,已经证明了Wnt通路在细胞的侵袭转移、细胞粘附和PCP过程中起到重要的调节作用。我们推测FAT4有可能通过wnt/β-catenin通路调控胃癌的侵袭转移。实验方法免疫组化检测160对胃癌及配对癌旁组织FAT4蛋白表达水平：根据FAT4着色的阳性细胞数和着色强度水平,采用染色强度评分和阳性细胞数评分的综合方法进行记分。分析FAT4蛋白表达与胃癌临床病理参数之间的关系,采用Kaplan-Meier法进行生存分析。qRT-PCR分别检测30对胃癌和配对癌旁组织FAT4 mRNA表达水平和不同胃癌细胞系FAT4表达水平。构建FAT4干扰细胞株。采用MTT、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验检测FAT4对细胞生长及侵袭的影响。采用Western blot、双荧光素酶报告基因检测等方法研究FAT4干扰对Wnt/β-catenin信号通路的影响。采用Western blot、MTT、克隆形成实验、Transwell侵袭实验、Transwell迁移实验检测β-catenin对FAT4干扰诱导的胃癌细胞生长及侵袭的影响。采用qRT-PCR、Western blot方法检测EMT信号分子E-cadherin、γ-Catenin、N-cadherin和Vimentin水平来研究FAT4干扰对胃癌EMT的影响。通过裸鼠皮下成瘤实验,裸鼠尾静脉注射肝、肺转移实验检测FAT4干扰对体内肿瘤生长及转移的影响。结果FAT4在胃癌组织中表达下调,160例胃癌组织中,38例胃癌组织标本FAT4表达阳性(23.8%),主要在细胞核、胞浆中表达。FAT4低表达与患者淋巴结转移(P=0.000)及存活率(P=0.017)显著相关。FAT4低表达患者预后较差(P=0.014)。胃癌组织中FAT4 mRNA表达水平也显著低于癌旁组织。与GES-1细胞相比,胃癌细胞株FAT4 mRNA表达水平下调。干扰FAT4可显著增强BGC-823细胞和HGC-27细胞增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力和迁移能力。干扰FAT4可增加胃癌细胞核内β-catenin水平,可显著增强β-catenin/TCF转录活性以及可以激活BGC-823细胞和HGC-27细胞的Wnt/β-catenin i言号通路。干扰FAT4并不影响总蛋白中β-catenin含量,而是通过促进β-catenin入核起到调节作用。干扰FAT4还可以诱导胃癌细胞上皮间质转化。干扰β-catenin可抑制shlFAT4转染的BGC-823细胞和HGC-27细胞的增殖能力、克隆形成能力、侵袭能力和迁移能力。干扰FAT4促进BGC-823细胞的裸鼠皮下成瘤能力,促进裸鼠体内肿瘤的肝、肺转移。结论本研究发现,与癌旁正常组织比较,FAT4在胃癌组织中呈低表达,并且其低表达和淋巴结转移及不良预后密切相关。在体内、体外实验中,下调FAT4都表现出了可以通过β-catenin依赖的机制促进肿瘤的生长,侵袭和转移。本研究结果提示,FAT4通过调控Wnt/β-catenin信号通路起到肿瘤抑制物的作用,这为胃癌的治疗提供了新的靶点。第二部分表达芯片加权共表达分析鉴定胃癌分子标记研究背景和目的肿瘤标志分子的研究一直都是肿瘤研究的热点。表达芯片给我们提供了一个可以大规模筛查肿瘤的分子标志物的手段。10余年来,人们积累了大量的基于表达芯片研究的数据。伴随着芯片数据量的增加,产生了许多新的研究方法和手段来分析处理大量的芯片数据。比如荟萃分析和共表达分析等。通过这些生物信息学的方法我们可以同时对大量芯片数据进行分析和深入的数据挖掘,找到疾病特异的差异基因和与临床特征相关的基因。其中基因的共表达分析方法是研究不同基因之间的相关性的重要手段。在本研究中,为了寻找胃癌预后的分子标志物,我们采用了加权基因共表达分析(WGCNA)的方法。WGCNA是一种在很多芯片中寻找基因共表达相互关系的系统生物学的方法。从它在2005年被首次提出以来,已经被广泛应用在动物学、植物性、微生物学、神经科学、肿瘤学、发育生物学、炎症和其他多种疾病的研究中。这种方法并不是研究成千上万个基因与样本特征的关系,而是关注一定数量的共表达的基因模块与样本某项特征的关系。使用WGCNA这一方法可以帮助我们发现潜在的生物学特征。实验方法所有芯片原始数据均从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)和Arrayexpress数据库(http://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/)下载。芯片数据集包括GSE13911, GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。配对的胃癌和癌旁正常组织的芯片资料来自GSE13911, GSE29272。胃癌临床特征数据的芯片来自GSE29272, GSE35809, GSE15459, GSE38749。含有胃癌预后资料的芯片来自GSE29272, GSE38749。所有数据集均采用Affymatrix公司人类全基因组芯片HG-U133A或HG-U133_Plus_2。采用R语言Bioconductor平台下的强健多芯片平均(gcRMA)的方法进行预处理。采用Bioconductor平台下的"affy"包对芯片进行标准化。我们应用“sva”包的ComBat功能,采用经验贝叶斯方法调整批次效应。采用Bioconductor平台的"limma"包分析差异表达的基因。我们设定差异倍数(FC)1.5和p0.05作为差异基因的筛选标准。我们采用R语言的"wgcna"软件包进行加权基因共表达网络的构建。将得到的胃癌差异表达基因根据基因之间的相关性分为不同模块。采用‘'wgcna"包得到模块的特征基因,以及模块内所有基因与该模块特征基因的相关性。采用"wgcna"包分析胃癌临床特征与各个模块和基因的相关性。用层次聚类的方法将所有基因分为高表达组和低表达组,采用R语言‘'survival"包和对所有基因进行COX生存分析,得到两组的风险比(HR)基因的GO分析和KEGG通路分析采用DAVID数据库进行分析。结果我们以FC1.5和p0.05为标准,共筛选出1592个差异探针,对应1161个差异基因。根据其在336个芯片中的表达水平,我们将1592个胃癌的差异表达探针进行分类,构建共表达模块。我们首先选择软阂值,在p=4的情况下,无标度网络的拟合指数接近0.90。我们然后采用非监督的平均链接分层聚类的方法构建了共表达模块,按照模块基因数20,模块融合高度0.25为标准,最后产生了11个模块。红色模块与患者年龄负相关,cor=-0.01,p=0.05；红色色块与性别正相关,cor=0.18,p=8x10-4,红色色块内基因在女性患者中高表达；棕色和黄色模块与劳伦分型成正相关,cor和p值分别为0.19,0.12和6×104和0.02；即棕色和黄色模块的特征基因在非肠型胃癌中高表达。而紫色模块与劳伦分型负相关,其cor=-0.11,p=0.05,提示紫色模块特征基因在肠型胃癌中高表达。黄色和红色模块特征基因和分化程度正相关,cor和p值分别为0.16、0.11和0.003、0.05；说明肿瘤的分化越差,这些基因的表达值越高；而蓝绿色、洋红色和粉色模块中,其特征基因在差分化的肿瘤中表达值下降,cor和p值分别为-0.12、-0.14、-0.13和0.003、0.01和0.02；洋红色、黄绿色、黑色、棕色模块与肿瘤的T分期负相关,cor和p值分别为-0.14、-0.11、-0.13、-0.18和0.01、0.05、0.02、0.001；肿瘤的T分期越高、这些模块特征基因的值约低。黄绿色、黑色和N分期正相关,cor和p值分别为0.15、0.13和0.005、0.02；说明随着N分期的增加,淋巴结转移数的增加,这两个模块特征基因的表达值逐渐增加。蓝色、黄色模块与N分期负相关,cor和p值分别为-0.21、-0.12和8x10-、0.03；说明随着N分期的增加,淋巴结转移数的增加,这两个模块特征基因的表达值逐渐降低。得到与某个临床特征相关的模块内所有探针与该模块特征基因的相关系数(MM)和与该临床特征的相关系数(GS)。绘制了模块内的所有基因的MM值和GS值的绘制散点图,得到核心基因。采用COX生存分析得到了160个与预后相关的探针(p0.05),对应149个基因。结论表达芯片的WGCNA方法可以使我们同时获得大量基因之间和基因与临床特性的相关信息,并得到与各个临床特征相关的核心基因。这些核心基因作为胃癌相关的分子标志值得进行深入的分子生物学研究。第三部分腹腔镜与开腹近端胃癌D2根治手术的疗效比较背景随着腹腔镜技术的快速发展,腹腔镜辅助的胃切除术(LAG)已经为广大医生和患者所接受。在全世界范围内,LAG的手术量逐年增加。近年来,很多项临床研究已经证实了LAG在胃癌手术中的应用价值,特别是在早期胃癌的治疗方面,LAG已经被写入指南并加以推荐。但是对于进展期胃癌患者是否适合采用腹腔镜辅助的D2根治术仍存在争议,进展期的近端胃癌就是争议的焦点之一。截止到目前,关于进展期近端胃癌的腹腔镜手术的相关研究少之又少,还不足以得到可靠的结论。所以我们进行了这项回顾性的队列研究,来比较腹腔镜辅助的保留胰脾的D2根治手术和传统的开放式保留胰脾的D2根治术对于进展期胃癌患者近远期疗效的影响。方法我们回顾了2008年3月到2012年3月间在我院行保留胰脾的D2根治术的进展期胃癌患者。其中腹腔镜手术组41例,开腹手术组43例。我们对这两组患者的近远期疗效进行了比较。结果两组中包括性别,BMI,年龄,并存疾病,ECOG评分等临床特征的基线资料比较没有显著差异。开腹手术的平均手术时间较腹腔镜手术组明显缩短,(188.72±44.429min OG组vs.269.15±49.167 min LAG组,p=0.001)。开腹手术组的估计失血量较腹腔镜手术组明显增加(303.26±163.616 ml OG组vs.219.51±125.438ml LAG组,p=0.010)。开腹手术组术后体温大于37℃的天数较腹腔镜手术组显著增加(6.0000±3.38062天OG组vs.3.3902±1.51456天LAG组,p=0.001)。两组术后并发症,清扫淋巴结数目,两组术后肿瘤浸润深度,TNM分期,组织学分级等病理结果比较均没有显著差异(p0.05)两组都没有发生围手术期的死亡,开腹组和腹腔镜组术后并发症的发生率分别为23.26%和14.63%,两组比较没有显著差异(p=0.314)。开腹手术组平均生存期38.664月,95%可信区间为33.252-44.075月；腹腔镜手术组平均生存期35.768月,95%可信区间为30.621-40.916月。两组总生存率差异没有统计学意义(对数秩检验p=0.710)。结论对于适合行保留胰脾的D2胃癌根治术的进展期胃癌患者,腹腔镜手术是一种安全有效的方式,其根治性、治愈率和生存率均与开腹手术相当。
[Abstract]:......
【学位授予单位】：第二军医大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R735.2

【相似文献】